王玉環(huán)

源自神經(jīng)上皮的腫瘤統(tǒng)稱為腦膠質(zhì)瘤，占顱腦腫瘤的40%～50%[1]，是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，年發(fā)病率為3～8人/10萬人口[2]。腦膠質(zhì)瘤在臨床上具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、死亡率高、治愈率低的特點(diǎn)[3]。目前，腦膠質(zhì)瘤的治療手段以手術(shù)切除為主，術(shù)后輔助以放療、化療等手段，預(yù)后不佳[4]。IDH1是三羧酸循環(huán)中重要的關(guān)鍵限速酶[5]，催化異檸檬酸氧化脫羧生成二氧化碳及α-酮戊二酸（α-KG），可為細(xì)胞新陳代謝提供能量和生物合成前體物質(zhì)[6]。近年來，Parsons等[7]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)IDH1的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生密切相關(guān)，并且在膠質(zhì)瘤的診斷、治療、預(yù)后有重要意義。本文以膠質(zhì)瘤作為研究樣本，通過Ventana Bench Mark ULTRA 全自動免疫組化染色法及手工免疫組化SP染色法了解IDH1突變情況，探索IDH1突變與膠質(zhì)瘤發(fā)展及其預(yù)后間的關(guān)系，為膠質(zhì)瘤診斷與治療提供理論依據(jù)，并為今后的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2017年1月—2018年4月廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除的13例經(jīng)病理學(xué)診斷為膠質(zhì)瘤的腫瘤標(biāo)本組織。13例患者術(shù)前均未接受藥物化療、放射治療等其他治療，并且排除合并其他全身性疾病。組織病理標(biāo)本由我科經(jīng)驗(yàn)豐富的主治醫(yī)師取材，然后經(jīng)固定、脫水、石蠟、包埋（制成蠟塊）、切片、染色并詳細(xì)篩選、復(fù)核后明確診斷為膠質(zhì)瘤。

1.2 試劑

即用型鼠抗人IDH1R132H單克隆抗體（克隆號：H09）， 購自福州邁新生科技術(shù)開發(fā)有限公司。ventana Bench Mark ULTRA全自動免疫組化儀上的試劑包括：DAB試劑盒（包含Ultra View Universal DAB inhibitor、Ultra View Universal HRP Multimer、Ultra View Universal DAB Chtomogen、Ultra View Universal DAB H2O2、Ultra ViewUniversal DAB Copper），脫蠟液（EzPrep），抗原修復(fù)液（CC1，pH8.5 Tris-EDTA），液體封蓋膜（LCS），蘇木精染液，靛藍(lán)染色液，清洗緩沖液（Reaction Buffer），緩沖液（SSC），以上試劑均購自羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

每例膠質(zhì)瘤病例取一塊帶有腫瘤的蠟塊，連續(xù)切片2張，切片厚約4 μm，黏貼于帶陽性對照的防脫載玻片上，60℃烤片1 h。切片內(nèi)正常腦組織表達(dá)陰性為內(nèi)對照。分別采用ventana Bench Mark ULTRA全自動免疫組化儀（實(shí)驗(yàn)組）與手工免疫組化SP染色法（對照組）進(jìn)行IDH1免疫組織化學(xué)檢測。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：IDH1陽性信號定位于細(xì)胞漿。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組結(jié)果

染色強(qiáng)度強(qiáng)、著色均勻、陽性定位準(zhǔn)確、背景清晰、干凈、無非特異染、結(jié)果容易判讀，見圖1。結(jié)果顯示IDHl表達(dá)陰性6例，陽性7例。

2.2 對照組結(jié)果

染色強(qiáng)度較弱、著色欠均勻、陽性定位不準(zhǔn)確、背景不清晰、有非特異染色、結(jié)果判讀受干擾，見圖2。結(jié)果顯示IDH1表達(dá)陰性6例，陽性7例。

3 討論

IDHI是體內(nèi)重要的氧化還原酶，是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一[8]。IDH1 突變后會催化α- 酮戊二酸還原為2- 羥基戊二酸，2-羥基戊二酸作為IDH 突變后生成的代謝廢物[9]，一般在人體細(xì)胞中含量很低，如果大量存在，會直接抑制人體內(nèi)組蛋白去甲基化酶與DNA 去甲基化酶等的多個(gè)重要雙加氧酶的活力[10]，改變細(xì)胞的生長方式和增值，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤[11]?？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)IDH1基因突變與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、預(yù)后有密切關(guān)系后，IDH1基因突變的檢測成為了膠質(zhì)瘤患者常規(guī)檢查項(xiàng)目之一[12]。本實(shí)驗(yàn)所用的克隆號為H09的IDH1，可特異性地檢測R132H類型的點(diǎn)突變。本研究表明：手工免疫組化SP染色法檢測結(jié)果一致。

圖1 實(shí)驗(yàn)組IDH1陽性（×40）

圖2 對照組IDH1陽性（×40）

免疫組化染色法從手工操作發(fā)展到半自動免疫組化儀再到全自動免疫組化儀操作，節(jié)省了人力成本和時(shí)間。手工免疫組化SP染色影響因素很多，例如抗體修復(fù)程度的把握，一抗孵育時(shí)間和溫度控制，且整個(gè)染色過程時(shí)間較長，一般需要4～24 h不等，如果大批量的操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。而全自動免疫組化染色儀從脫蠟開始、孵育、抗原修復(fù)、抗體滴加、孵育、DAB顯色完成整個(gè)過程都在線完成，通過軟件準(zhǔn)確控制所有試劑的孵育時(shí)間和溫度，染色結(jié)果穩(wěn)定。作者在同一張待測片上黏貼陽性對照片，陽性對照與待檢測組織在同一張切片上進(jìn)行染色，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)條件的一致性，同時(shí)有陽性對照和陰性內(nèi)對照，達(dá)到了免疫組化染色的標(biāo)準(zhǔn)化，增加了染色結(jié)果準(zhǔn)確性。此外切片也可直接歸檔保存，不需要單獨(dú)保存陽性對照切片，一舉兩得。作者通過對比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)全自動免疫組化染色儀染色較手工法陽性表達(dá)定位準(zhǔn)確、著色均勻、背景清晰、無非特異染色，并且操作簡單、運(yùn)行時(shí)間短，可以批量化操作大大節(jié)省了勞動力，提高了工作效率。機(jī)子所有的廢液都回收，不直接排放，節(jié)能環(huán)保。

通過對IDH1 免疫組化染色結(jié)果的分析，作者發(fā)現(xiàn)突變只發(fā)生于腫瘤細(xì)胞自身，正常的血液細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等無染色。IDH1染色強(qiáng)度與腫瘤細(xì)胞級別無關(guān)。WHOⅡ級的彌漫性星形細(xì)胞瘤，WHOIII級的間變性星形細(xì)胞瘤，或者WHOIV級的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，IDH1突變陽性的腫瘤細(xì)胞并沒有隨著腫瘤級別的進(jìn)展而增加，不呈正相關(guān)的關(guān)系。

綜上所述，全自動免疫組化染色儀染色較手工法陽性表達(dá)定位準(zhǔn)確、著色均勻、背景清晰、無非特異染色，并且操作簡單、運(yùn)行時(shí)間短，可以批量化操作，大大節(jié)省了勞動力，提高了工作效率。推薦全自動免疫組化法作為臨床檢測IDH1基因突變的首選方法。