黃大野，高 葦，賁海燕，方 偉，王開(kāi)梅，曹春霞※，饒 犇，劉曉艷，萬(wàn)中義，張亞妮，姚經(jīng)武，朱志剛

（1. 湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，武漢430064；2. 天津市農(nóng)科院植物保護(hù)研究所，天津 300381；3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069）

0 引 言

由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的灰霉病是番茄的主要?dú)缧圆『?，能侵染果?shí)、花、葉、莖和種子[1-2]。防治該病害主要依靠單一作用位點(diǎn)的化學(xué)殺菌劑，如多菌靈、異菌脲、嘧菌環(huán)胺和啶酰菌胺等。但是，化學(xué)殺菌劑的使用極易造成灰霉病產(chǎn)生抗藥性，在中國(guó)和世界范圍內(nèi)，灰葡萄孢已經(jīng)對(duì)多種殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性[3-8]。另外也會(huì)造成農(nóng)藥殘留及環(huán)境污染并威脅人類健康[9-10]。所以生產(chǎn)上急需更為安全有效的殺菌劑和防治方法。

與化學(xué)殺菌劑相比，生物制劑具有很多優(yōu)勢(shì)，利用多種作用機(jī)理來(lái)抑制病害的發(fā)生，如競(jìng)爭(zhēng)位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)、重寄生作用、誘導(dǎo)抗性和產(chǎn)生次生抑菌物質(zhì)等[11-13]。鏈霉菌是一種被廣泛利用的生防菌，可以產(chǎn)生多種類型的天然產(chǎn)物，作為防治作物病害活性化合物。許多鏈霉菌產(chǎn)生的天然產(chǎn)物如多氧霉素、春雷霉素和井崗霉素等已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[14-16]鏈霉菌產(chǎn)生的。

諾沃霉素A和B是由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和鑒定的2種全新結(jié)構(gòu)的32元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類化合物分子量 1 228.66。其產(chǎn)生菌為植生鏈霉菌（Streptomyces phytohabitans），菌種代號(hào)為 HBERC-20821， 保存在武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO：M2013379。鏈霉菌分離自四川瓦屋山采集的土樣。前期研究了液體發(fā)酵制備諾沃霉素的方法和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用的簡(jiǎn)單濃縮工藝[17-19]。大鼠急性經(jīng)口、經(jīng)皮和吸入試驗(yàn)表明未造成明顯病理改變，毒性為微毒級(jí)[20]。通過(guò)瓊脂稀釋法測(cè)定了諾沃霉素A和B對(duì)幾種植物病原菌minimum inhibition concentration（最小抑制濃度），結(jié)果表明對(duì)禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和穎枯殼針孢（Septoria nodorum）等幾種植物病原真菌具有良好抑制效果。諾沃霉素A和B只在側(cè)鏈有一處細(xì)微區(qū)別，母核結(jié)構(gòu)相同。前期初步測(cè)定殺菌活性，發(fā)現(xiàn)殺菌活性無(wú)明顯差異，故只對(duì)A殺菌性能進(jìn)行進(jìn)一步研究[19]。本試驗(yàn)選取諾沃霉素A進(jìn)行對(duì)番茄果實(shí)灰霉病的防治效果研究，以期為諾沃霉素今后在防治番茄采后灰霉病的應(yīng)用和推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：灰葡萄孢（B. cinerea）為多菌靈敏感菌株，核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）、多主棒孢（Corynespora cassiicola）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、茶褐斑擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis guepinii）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）和勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）均由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離和保存。

供試藥物：諾沃霉素 A原藥（有效成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%），制備方法參考文獻(xiàn)[17]。98%多菌靈原藥（安徽廣信農(nóng)化股份有限公司）。番茄為市場(chǎng)購(gòu)買大番茄，品種為紅星二號(hào)。

1.2 諾沃霉素A對(duì)灰葡萄孢離體抑菌效果

將灰葡萄孢菌從保存斜面活化到potato dextrose ager（PDA）培養(yǎng)基20℃培養(yǎng)5 d備用。將諾沃霉素A原藥加入母液體積 1%N，N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide）溶解，隨即加入無(wú)菌水配制成濃度為100μg/mL母液備用。多菌靈母液的配制方法和濃度同諾沃霉素 A。采用菌絲生長(zhǎng)速率法，使用梯度稀釋將諾沃霉素 A 稀釋至25、12.5、6.25、3.125 和1.562 5μg/mL。多菌靈稀釋至10.0、5.0、2.5、1.0和0.5μg/mL。待培養(yǎng)基溫度降為45 ℃時(shí)，用滅菌槍頭吸取1 mL藥液，隨后加入9 mLPDA培養(yǎng)基混勻，即藥液稀釋10倍，每個(gè)梯度濃度3次重復(fù)，以加入含1%DMF無(wú)菌水作為對(duì)照。隨后用4 mm直徑打孔器打取PDA平板培養(yǎng)的灰葡萄孢，接入各處理PDA平板中央。20℃黑暗培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測(cè)量每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)菌落直徑，用DPS軟件求出諾沃霉素A和多菌靈對(duì)灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù)r和抑制中濃度EC50（50% effective concentration）。

分別挑取少許含1.25μg/mL諾沃霉素A平板和對(duì)照菌絲于載玻片，在40倍光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS CX21,Tokyo，Japan）觀察處理和對(duì)照菌絲形態(tài)。

1.3 諾沃霉素A防治番茄果實(shí)灰霉病研究

將灰葡萄孢菌在PDA平板25℃培養(yǎng)14 d，用無(wú)菌水刷取孢子懸浮液，將其混入 0.05%的吐溫 80，隨后用紗布過(guò)濾，使用血球計(jì)數(shù)板將孢子濃度調(diào)到 5×104個(gè)孢子/mL。從市場(chǎng)購(gòu)買大小一致，外皮沒(méi)有破損的番茄。

用帶1 mL無(wú)菌槍頭分子槍在番茄中部相對(duì)應(yīng)的兩側(cè)打孔，將諾沃霉素 A 稀釋至 50 和 100μg/mL，浸果10 min，對(duì)照藥劑使用有效成分25和12.5μg/mL多菌靈浸果10 min，空白對(duì)照使用無(wú)菌水浸果10 min。取出風(fēng)干后滴入10μL灰霉孢子懸浮液，25℃保濕培養(yǎng)6 d[21-26]，試驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)番茄果實(shí)。統(tǒng)計(jì)方法和防效計(jì)算同上。

1.4 諾沃霉素A抑菌譜測(cè)定

按照1.2制備100μg/mL諾沃霉素A，采用菌絲生長(zhǎng)速率法觀察10μg/mL含藥PDA培養(yǎng)基條件下對(duì)7種常見(jiàn)植物病原菌抑制效果，以加入質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%DMF無(wú)菌水作為對(duì)照。防效計(jì)算方法同上。勞爾氏菌在nutrient ager（NA）平板活化，挑取單菌落轉(zhuǎn)入 SPA培養(yǎng)基，于170 r/min轉(zhuǎn)速、30℃培養(yǎng) 24 h 后，將菌液均稀釋至108cfu/mL，將0.5 mL菌液與45℃ 9.5 mL NA固體培養(yǎng)基混合制成含菌平板。隨后放入滅菌濾紙片，滴入10μL諾沃霉素A藥液，對(duì)照藥劑為平板濃度10μg/mL氨芐青霉素鈉，3 d后觀察抑菌圈。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用DPS進(jìn)行毒力回歸方程計(jì)算，SAS9.1.3進(jìn)行差異顯著性分析，在0.05水平下進(jìn)行單因素差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾沃霉素A對(duì)灰葡萄孢離體抑菌效果

表1為諾沃霉素A與多靈菌抑菌活性對(duì)比，諾沃霉素A對(duì)灰葡萄孢具有良好的抑菌活性，離體條件下在2.5、1.25、0.625、0.312 5和0.156 25μg/mL 5個(gè)梯度濃度均有一定的抑菌效果，經(jīng)計(jì)算EC50為0.631μg/mL，相關(guān)系數(shù)r為0.999 7，說(shuō)明試驗(yàn)濃度梯度設(shè)置合理。生產(chǎn)上防治灰霉病常用殺菌劑多菌靈EC50為0.157μg/mL，諾沃霉素A殺菌活性略低于多菌靈。與對(duì)照菌絲相比，經(jīng)1.25μg/mL諾沃霉素A處理5 d后灰葡萄孢菌絲發(fā)生明顯的膨脹、扭曲和變形（圖 1），菌絲微觀形態(tài)的影響可能是抑制灰霉病生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。

表1 諾沃霉素A對(duì)灰葡萄孢抑菌活性Table 1 Inhibition activity of novonestmycin A on Botrytis cinerea

圖1 顯微鏡條件下諾沃霉素A對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響Fig.1 Optical micrographs of the inhibition of fungal growth by novonestmycin A

2.2 諾沃霉素A預(yù)防番茄果實(shí)灰霉病效果

表 2為諾沃霉素 A、多靈菌及對(duì)照組對(duì)番茄灰霉病預(yù)防效果對(duì)比，離體組織試驗(yàn)表明，諾沃霉素 A對(duì)番茄果實(shí)灰霉病具有良好的防治效果。諾沃霉素 A在 50和100μg/mL浸果處理對(duì)番茄果實(shí)灰霉病防效分別達(dá)到68.29%和100%。多菌靈在12.5和25μg/mL浸果處理對(duì)番茄果實(shí)灰霉病防效分別為69.51%和100%。在處理濃度下諾沃霉素A和多菌靈對(duì)番茄果實(shí)灰霉病預(yù)防效果相當(dāng)（P<0.05）。試驗(yàn)過(guò)程中在50和100μg/mL浸果處理?xiàng)l件下均未發(fā)現(xiàn)諾沃霉素對(duì)番茄果實(shí)表觀造成藥害，試驗(yàn)濃度下對(duì)番茄果表觀形態(tài)安全（見(jiàn)圖2）。100μg/mL及更高濃度可以作為實(shí)際應(yīng)用中諾沃霉素A的浸果濃度，更高濃度諾沃霉素A對(duì)番茄果實(shí)安全性及最佳浸果時(shí)間需要進(jìn)一步研究。

表2 諾沃霉素A對(duì)番茄灰霉病預(yù)防效果Table 2 Prevention of novonestmycin A on tomato gray mold

圖2 諾沃霉素A對(duì)番茄果實(shí)灰霉預(yù)防效果Fig.2 Prevention effect of novonestmycin A on tomato fruit gray mold

2.3 諾沃霉素A抑菌譜

抑菌譜試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，試驗(yàn)表明，諾沃霉素 A在10μg/mL條件下對(duì)子囊菌核盤(pán)菌S.sclerotiorum抑菌率為86.11%、對(duì)半知菌多主棒孢C.cassiicola、茄鏈格孢A.solani、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、茶褐斑擬盤(pán)多毛孢P.guepinii和擔(dān)子菌立枯絲核菌R.solani抑菌效果分別為91.11%、82.78%、77.22%、86.46%和85.56%，抑菌率均達(dá)到75%以上。對(duì)卵菌綱辣椒疫霉P.capsici無(wú)抑菌作用。在細(xì)菌抑菌試驗(yàn)中，抑菌圈法表明諾沃霉素A在10μg/mL處理?xiàng)l件下對(duì)勞爾氏菌R.solanacearum無(wú)抑菌圈，而對(duì)照殺細(xì)菌藥劑氨芐青霉素鈉在相同濃度下具有明顯抑菌圈（圖 3），即諾沃霉素 A對(duì)細(xì)菌勞爾氏菌R.solanacearum無(wú)抑菌效果。諾沃霉素A在防治半知菌引起的作物病害表現(xiàn)出一定的防治潛力，對(duì)由上述病原菌引起的病害的田間防效、應(yīng)用技術(shù)及對(duì)應(yīng)作物的安全性需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

表3 諾沃霉素A對(duì)植物病原菌離體抑菌效果Table 3 In vitro inhibition of plant pathogens with novonestmycin A

圖3 諾沃霉素對(duì)勞爾氏菌抑菌活性Fig.3 Inhibition activity of novonestmycin A on Ralstonia solanacearum

3 討 論

研究表明諾沃霉素A對(duì)番茄果實(shí)灰霉病具有良好的預(yù)防效果，對(duì)其作用機(jī)理和與其他灰霉病防治藥劑的交互抗藥性值得進(jìn)一步研究，為灰霉病抗性菌株的治理和殺菌劑交替和混合使用奠定基礎(chǔ)。

諾沃霉素A對(duì)常見(jiàn)植物病原真菌核盤(pán)菌、膠孢炭疽和立枯絲核菌等具有良好抑制效果，其離體抑菌活性均為首次報(bào)道。其對(duì)卵菌綱疫霉菌無(wú)效，不能用于其引起的作物疫病的防治。對(duì)細(xì)菌勞爾氏菌無(wú)效，不能用于其引起的作物細(xì)菌青枯病防治。本研究共研究 9種病原菌抑菌活性，還需對(duì)其抑菌譜進(jìn)行更深入的研究。在試驗(yàn)濃度下，對(duì)番茄表皮未造成影響，高濃度下對(duì)番茄的安全性需要進(jìn)一步研究。

最近的研究表明大環(huán)內(nèi)酯類化合物抑菌機(jī)理為直接與真菌細(xì)胞膜麥角甾醇結(jié)合從而抑制真菌生長(zhǎng)[27-29]。麥角甾醇是子囊菌、擔(dān)子菌和半知菌等大多數(shù)真菌細(xì)胞膜重要組成部分，卵菌綱病害和細(xì)菌不含有麥角甾醇[30]。諾沃霉素A對(duì)卵菌綱辣椒疫霉菌P. capsici和細(xì)菌勞爾氏菌R.solanacearum無(wú)效，而對(duì)其他隸屬于囊菌、半知菌和擔(dān)子菌 6種真菌具有明顯的抑菌效果。通過(guò)其化學(xué)結(jié)構(gòu)類型和抑菌譜研究表明麥角甾醇可能為諾沃霉素A抑制真菌的作用靶標(biāo)，藥劑對(duì)真菌麥角甾醇合成影響需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

大環(huán)內(nèi)脂類抗生素納他霉素通過(guò)作用于麥角甾醇而對(duì)大多數(shù)真菌和酵母菌具有抑制和殺滅活性，其具有不易產(chǎn)生抗藥性，無(wú)致癌、致畸形、致突變和過(guò)敏性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品防腐和水果保鮮[31]。同為大環(huán)內(nèi)酯諾沃霉素在食品防腐和其他水果保鮮，例如柑橘青霉病的應(yīng)用值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)離體抑菌、果實(shí)預(yù)防和抑菌譜試驗(yàn)，研究結(jié)果如下：

1）諾沃霉素A對(duì)灰葡萄孢具有良好的抑菌效果，離體抑制中濃度為0.631μg/mL。

2）經(jīng)1.25μg/mL 諾沃霉素A處理的菌絲發(fā)生明顯的腫脹和變形。經(jīng)50和100μg/mL諾沃霉素A浸果處理對(duì)番茄果實(shí)灰霉病防效分別為68.29%和100%。對(duì)番茄安全無(wú)藥害，在防治番茄果實(shí)灰霉病具有良好的應(yīng)用前景。

3）諾沃霉素A對(duì)核盤(pán)菌、膠孢炭疽和立枯絲核菌等常見(jiàn)植物病原真菌具有抑菌效果，對(duì)卵菌綱辣椒疫霉P.capsici和細(xì)菌勞爾氏菌R.solanacearum無(wú)效。

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