王偉麗， 何立平， 余敏芬， 袁虎威， 閆道良， 趙 亮， 余有祥，劉 軍， 趙 鸝， 鄭炳松

北美冬青Ilex verticillata又名輪生冬青、美洲冬青，是冬青科Aquifoliaceae冬青屬Ilex多年生灌木，原產(chǎn)美國東北部，雌雄異株，多生長在低洼地區(qū)，也可生長在較為干燥的過渡區(qū)和山地。與冬青科其他常綠樹種相比，北美冬青具有秋冬落葉、果期長等特點。秋冬季節(jié)，北美冬青紅果掛枝、顏色鮮亮，觀賞價值極高［1］，可用于切枝觀賞、居室盆栽和景觀美化等。北美冬青品種選育工作在歐美國家已開展了多年，優(yōu)良品種也較多［2-3］；在中國，北美冬青也得到了越來越多的關(guān)注，但品種引種工作尚處于起步階段，僅見于浙江、山東、河南和吉林等地，育種工作更是幾近空白。親緣分析是育種中的重要工作，是保障育種質(zhì)量的重要前提。分子標記是進行親緣分析的有效工具［4］。簡單重復序列間擴增多態(tài)性（inter-simple sequence repeat,ISSR）是一種以簡單重復序列（simple sequence repeat,SSR）作為引物，基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)，在多個位點上擴增SSR之間DNA片段的分子標記技術(shù)［4］，由加拿大蒙特利爾大學于1994年創(chuàng)建，具有多態(tài)性高、操作簡便、成本低等特點［5］，在遺傳多樣性評價、親緣分析、系統(tǒng)發(fā)育、圖譜構(gòu)建、分子輔助育種等方面具有重要應用，已成為植物種質(zhì)資源遺傳基礎(chǔ)研究的重要技術(shù)［6-11］， 成功應用于核桃Juglans regia［12］， 檉柳Tamarix chinensis［13］， 藺草Juncus effusus［14］， 紅花檵木Loropetalum chinensevar.rubrum［15］， 馬鈴薯Solanum tuberosum［16］， 櫻花Cerasus yedoensis［17］等物種的品種鑒定、種質(zhì)資源收集、遺傳多樣性和系統(tǒng)進化分析中。本研究擬在前期對國內(nèi)外北美冬青品種搜集、調(diào)查的基礎(chǔ)上，以12個北美冬青品種為材料，利用多態(tài)性ISSR引物在品種間進行PCR擴增，構(gòu)建北美冬青品種間的分子指紋圖譜，鑒定品種間親緣關(guān)系，為北美冬青新品種選育提供保障。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

以杭州潤土園藝科技有限公司北美冬青基地中的12個北美冬青品種為鑒定材料，以落葉冬青Ilex decidua為遠緣對照（ck），12個北美冬青品種及對照的基本信息見表1。采集各北美冬青品種及落葉冬青的幼嫩葉片，迅速放入液氮中帶回，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 北美冬青品種信息Table 1 Ilex verticillata cultivar information

1.2 DNA的提取及質(zhì)量檢測

采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）提取北美冬青基因組DNA［5］。用NanoDrop-1000型分光光度計檢測DNA的濃度和純度；用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.3 ISSR引物篩選及擴增

以12條已報道的冬青屬ISSR引物為候選引物［表2，由生工生物工程（上海）有限公司合成］，以提取的各北美冬青品種基因組DNA為模板進行PCR擴增。ISSR-PCR擴增反應體系共20.0 μL，包含三磷酸堿基脫氧核苷酸（dNTPs） 3.2 μL， 10×緩沖液 2.0 μL，模板 DNA 1.0 μL， 引物 1.0 μL， 超純水 12.6 μL，rTaq酶 0.2 μL （Takara， 日本）。ISSR-PCR擴增程序：94.0℃預變性 4 min；94.0℃變性 70 s，51.3～61.0℃退火50 s，72.0℃延伸70 s，共35個循環(huán)；72.0℃延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳時間為40 min，電泳條帶在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。

表2 冬青屬ISSR引物Table 2 ISSR primers for Ilex

1.4 統(tǒng)計分析

以0和1分別代表條帶的有和無，統(tǒng)計各ISSR引物對12個北美冬青品種的擴增情況。用NTSYSpc 2.10e軟件計算各品種間的遺傳相似系數(shù)，得到相似系數(shù)矩陣；基于相似系數(shù)矩陣用非加權(quán)組平均法（UPGMA）進行品種間聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 12個北美冬青品種的ISSR分子指紋圖譜

以12條待測ISSR引物為候選引物，R1～R4品種基因組DNA為模板進行PCR擴增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在12條待測引物中篩選出4條在各品種間具有多態(tài)性、擴增條帶清晰的ISSR引物（ZBSI-002， ZBSI-004， ZBSI-007， ZBSI-009），并以篩選出的多態(tài)性引物對各品種的基因組DNA進行PCR擴增，構(gòu)建DNA指紋圖譜。以ZBSI-002引物為例（圖1），12個北美冬青品種間在該引物的擴增位點上多態(tài)性較高，初步顯示了品種間存在一定的遺傳差異。檢測引物擴增位點上的基因型分型情況可知，12個北美冬青品種在4條ISSR引物擴增位點上共擴增出63個條帶，其中多態(tài)性條帶的比例占90.48%，說明所選引物的多態(tài)性較高，可以用于鑒定12個北美冬青品種間的親緣關(guān)系（表3）。

圖1 12個北美冬青品種的ZBSI-002引物指紋圖譜Figure 1 Fingerprints of ISSR primer ZBSI-002 between the 12 cultivars of Ilex verticillata

2.2 12個北美冬青品種的親緣關(guān)系

12個北美冬青品種的遺傳相似系數(shù)為0.54～0.87，僅個別低于0.60（表4），說明各品種的親緣關(guān)系較近。作為對照的落葉冬青（ck）與各北美冬青品種的遺傳相似性系數(shù)為0.44～0.68，明顯低于北美冬青品種之間的遺傳相似系數(shù)（表4），說明北美冬青和落葉冬青種間的親緣關(guān)系低于北美冬青種內(nèi)親緣關(guān)系，與客觀實際相符。

12個北美冬青品種間的遺傳相似系數(shù)聚類結(jié)果表明：北美冬青品種間存在不同程度的親緣關(guān)系。由圖2可知：R6與其他品種的親緣關(guān)系較遠，R9與R10間親緣關(guān)系較近，對比品種的信息（表1）可知，R9與R10為同一品種的雌雄株，其親緣關(guān)系近是合理的。此外，R7和R11的親緣關(guān)系最近，甚至比R9和R10之間的親緣關(guān)系還近，說明根據(jù)特定表型性狀篩選出來的不同北美冬青品種，其在遺傳水平上的差異可能并不明顯。

表3 北美冬青品種在4條ISSR引物位點上的擴增條帶Table 3 Statistics of bands amplified by 4 ISSR primers in the 12 cultivars of Ilex verticillata

表4 北美冬青品種間在4條ISSR引物位點上的遺傳相似系數(shù)Table 4 Genetic similarity coefficients of 4 ISSR primers in Ilex verticillata cultivars

3 討論與結(jié)論

ISSR作為一種重要的分子標記技術(shù)，已廣泛應用于種質(zhì)鑒定、分子標記輔助選擇、遺傳多樣性評價、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建及基因定位等多個領(lǐng)域，并取得了許多重要的成果。目前，分子標記技術(shù)雖尚未應用于北美冬青，但在冬青屬其他植物已有應用。付銓盛［18］采用ISSR分子標記技術(shù)對華南地區(qū)5個省份28個毛冬青Ilex pubescens樣品進行了分析，平均相似系數(shù)為0.769 3；UPGMA聚類分析結(jié)果表明：在0.34水平上禿毛冬青Ilex pubescensvar.glabra與毛冬青存在明顯分支。錢永生等［19］利用隨機擴增多態(tài)性 DNA（RAPD）和擴增片段長度多態(tài)性（AFLPs）標記技術(shù)對10種冬青進行了親緣關(guān)系鑒定，發(fā)現(xiàn)不同種間多態(tài)率分別為91.30%和98.60%。冷欣等［20］運用ISSR分子標記技術(shù)對浙江省舟山群島全緣冬青Ilex integra的6個種群共57個個體進行了遺傳多樣性分析，利用9條隨機引物共擴增出45條多態(tài)性條帶，多態(tài)率為57.70%；UPGMA聚類分析結(jié)果表明：親緣關(guān)系較近的為普陀島和朱家尖島的種群，舟山島栽培種群由桃花島自然種群移植而來。

圖2 12個北美冬青品種遺傳相似系數(shù)聚類Figure 2 Clustering of genetic similarity coefficients among 12 cultivars of Ilex verticillata

本研究利用4條ISSR引物對12個北美冬青品種間的親緣關(guān)系進行了分析，共獲得57條多態(tài)性片段，多態(tài)率達90.48%。品種間遺傳相似系數(shù)為0.54～0.87，表明各品種間的親緣關(guān)系相對較近。品種間遺傳相似系數(shù)聚類結(jié)果表明：北美冬青品種間存在不同程度的親緣關(guān)系；盡管在形態(tài)學上非常相近，但利用ISSR分子標記也能明顯的鑒別出各個品種間細微的DNA差異，說明ISSR分子標記在北美冬青親緣關(guān)系的鑒定上具有可行性。

本研究對12個北美冬青品種間的親緣分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Ilex verticillata‘Jim Dandy’（R7）和I.verticillata‘Cacapon’（R11）間親緣關(guān)系最近， 相較I.verticillata×serrata‘Sparkleberry’這一品種雌雄株（R9和R10）的親緣關(guān)系更近，這說明基于表型篩選出來的不同品種，其遺傳水平上的差異可能并不大。此外，從品種表型特征與遺傳學間親緣關(guān)系上來看，I.verticillata‘Afterglow’（R8）與I.verticillata‘Red Sprite’（R3）的株型、葉片及花期等較為相近，在遺傳水平上的親緣關(guān)系也較近；從各品種來源與遺傳學親緣關(guān)系上來看，來自荷蘭的I.verticillata‘Oosterwijk’（R1）與來自美國的其他11個北美冬青品種并非分成獨立的2個類別，而是與來自美國的5個品種（I.verticillata‘Winter Red’，I.verticillata×serrata‘Sparkleberry’，I.verticillata‘Jim Dandy’等）聚在同1個大類中，因此，不能僅根據(jù)植株的表型特征和來源確定各個品種間的親緣關(guān)系。基于本研究的結(jié)果，我們建議在今后北美冬青育種過程中可參照親緣分析結(jié)果，通過親緣關(guān)系較遠的品種間的雜交等創(chuàng)建新的優(yōu)良種質(zhì)，以保證育種群體的遺傳多樣性水平；同時，也可以將新的品種融入到現(xiàn)有育種群體中來，以擴展現(xiàn)有育種群體的遺傳多樣性基礎(chǔ)，保證北美冬青改良的長期、可持續(xù)發(fā)展。

4 參考文獻

［1］ DIRR M A.Manual of Woody Landscape Plants［M］.6th Ed.Ellinois：Stipes Publishing LLC,2009：537-541.

［2］ 錢萍， 季春峰.美國州樹研究［J］.江西林業(yè)科技，2011（6）：26-27.QIAN Ping,JI Chunfeng.Research on state trees of United States.［J］.J Jiangxi For Sci Technol,2011（6）：26-27.

［3］ BAILES C.Hollies for Gardeners［M］.Portland：Timber Press,2006：170-173.

［4］ 趙謙，杜虹，莊東紅.ISSR分子標記及其在植物研究中的應用［J］.分子植物育種，2007，5（6S）：123-129.ZHAO Qian,DU Hong,ZHUANG Donghong.ISSR molecular marker and its application in plant research ［J］.Mol Plant Breed,2007,5（6S）：123-129.

［5］ 周喜軍.冬青屬植物ISSR分子標記及枸骨組織培養(yǎng)體系的建立［D］.鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學，2009.ZHOU Xijun.Inter-Simple Sequence Repeat Molecular Markers in Ilex and the Tissue Cculture System of Ilex cornuta Lindl ex Paxt［D］.Zhengzhou：Henan Agricultural University,2009.

［6］ REDDY M P,SARLA N,SIDDIQ E A.Inter simple sequence repeat （ISSR） polymorphism and its application in plant breeding ［J］.Euphytica,2002,128（1）：9-17.

［7］ 陳良華，胡庭興，張帆，等.用AFLP技術(shù)分析四川核桃資源的遺傳多樣性［J］.植物生態(tài)學報，2008，32（6）： 1362-1372.CHEN Lianghua,HU Tingxing,ZHANG Fan,et al.Genetic diversity of fourJuglanspopulations revealed by AFLP in Sichuan Province,China ［J］.J Plant Ecol,2008,32（6）：1362-1372.

［8］ POTTER D,GAO Fangyou,AIELLO G.Inter-simple sequence repeat markers for fingerprinting and determining genetic relationships of walnut（Juglans regia） cultivars ［J］.J Amer Soc Hort Sci,2002,127（1）：75-81.

［9］ 王滑，郝俊民，王寶慶，等.中國核桃8個天然居群遺傳多樣性分析［J］.林業(yè)科學，2007，43（7）：120-124.WANG Hua,HAO Junmin,WANG Baoqing,et al.SSR analysis of genetic diversity of eight natural walnut populations in China ［J］.Sci Silv Sin,2007,43（7）：120-124.

［10］ 陳良華，胡庭興，張帆.核桃與鐵核桃種間關(guān)系的RAPD鑒定［J］.四川農(nóng)業(yè)大學學報，2007，25（4）：513-516.CHEN Lianghua,HU Tingxing,ZHANG Fan.Identification of relationship betweenJuglans regiaL.andJ.sigillataDode by RAPD markers ［J］.J Sichuan Agric Univ,2007,25（4）：513-516.

［11］ 陳少瑜，楊恩，張雨，等.云南核桃品種遺傳多樣性的RAPD和ISSR標記研究［J］.河北林果研究，2007，22（1）： 56-61.CHEN Shaoyu,YANG En,ZHANG Yu,et al.Genetic diversity ofJuglans silillataDode varieties by RAPD and ISSR markers ［J］.Hebei J For Orchard Res,2007,22（1）：56-61.

［12］ POLLEGIONI P,BARTOLI S,CANNATA F,et al.Genetic differentiation of four Italian walnut （Juglans regiaL.）varieties by inter simple sequence repeat（ISSR） ［J］.J Genet Breed,2003,57：231 － 240.

［13］ JIANG Zhimin,CHEN Yuxia,BAO Ying.Population genetic structure ofTamarix chinensisin the Yellow River Delta,China ［J］.Plant Syst Evol,2012,298（1）：147 － 153.

［14］ 柴曉娟，郭瑋龍，陳慧，等.藺草種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析［J］.浙江農(nóng)林大學學報，2017，34（3）：552－558.CHAI Xiaojuan,GUO Weilong,CHEN Hui,et al.Genetic diversity ofJuncus effusesgermplasm by ISSR markers［J］.J Zhejiang A&F Univ,2017,34（3）：552 － 558.

［15］ 董海燕，季孔庶，侯伯鑫，等.基于ISSR標記的紅花檵木品種親緣關(guān)系分析［J］.園藝學報，2014，41（2）：365－374.DONG Haiyan,JI Kongshu,HOU Boxin,et al.Genetic relatives analysis of 41Loropetalum chinensevar.rubrumcultivars by ISSR markers ［J］.Acta Hortic Sin,2014,41（2）：365 － 374.

［16］ 田大翠，朱宏波，郭建夫，等.馬鈴薯遺傳多樣性的ISSR分析［J］.中國馬鈴薯，2010，24（1）：1－5.TIAN Dacui,ZHU Hongbo,GUO Jianfu,et al.Genetic diversity analysis based on potato ISSR ［J］.Chin Potato J,2010,24（1）：1 － 5.

［17］ 林立，王志龍，付濤，等.39個櫻花品種親緣關(guān)系的ISSR分析［J］.植物研究，2016，36（2）：297－304.LIN Li,WANG Zhilong,FU Tao,et al.Genetic relationships of 39Cerasuscultivars by ISSR analysis ［J］.Bull Bot Res， 2016,36（2）：297 － 304.

［18］ 付銓盛.毛冬青ISSR指紋圖譜的建立及成分動態(tài)規(guī)律初探［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學，2016.FU Quansheng.Establish Fingerprint for Ilex pubescens based on ISSR PCR and Preliminary of Ingredients Cumulative［D］.Guangzhou：Guangzhou University of Chinese Medicine,2016.

［19］ 錢永生，王慧中，施農(nóng)農(nóng)，等.10種冬青屬植物遺傳多樣性的RAPD和AFLPs分析［J］.分子細胞生物學報，2008， 41（1）： 35 － 43.QIAN Yongsheng,WANG Huizhong,SHI Nongnong,et al.Studies of genetic diversity among 10 species ofIlexbased on RAPD and AFLPs ［J］.J Mol Cell Biol,2008,41（1）：35 － 43.

［20］ 冷欣，王中生，安樹青，等.島嶼特有種全緣冬青遺傳多樣性的ISSR分析［J］.生物多樣性，2005，13（6）：546－554.LENG Xin,WANG Zhongsheng,AN Shuqing,et al.ISSR analysis of genetic diversity ofIlex integra,an insular endemic plant［J］.Biodivers Sci,2005,13（6）：546 － 554.