周欣蕓 周龍甫 陳 欣 向 熙 呼永河,

(1.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，成都 610036)(2.成都市軍區(qū)總醫(yī)院，成都 610036)

哮喘是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重影響公共健康的慢性疾病，其發(fā)病率和嚴(yán)重性逐年增高，環(huán)境是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的重要原因。高濕環(huán)境多由氣候或者特殊的生活、工作環(huán)境造成，廣泛分布于世界各地[1]。大量流行病學(xué)研究證明高濕環(huán)境是誘發(fā)或者加劇哮喘的重要因素，長時(shí)間暴露于高濕環(huán)境可導(dǎo)致哮喘發(fā)病率明顯增加，但機(jī)制不明[2-3]。為了探索高濕環(huán)境影響哮喘的具體機(jī)制，需要建立穩(wěn)定可靠的高濕哮喘動(dòng)物模型，但目前尚缺乏研究高濕環(huán)境對(duì)哮喘影響的具體動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)采用卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)致敏激發(fā)高濕環(huán)境的雌性BALB/c小鼠，探討高濕環(huán)境下哮喘動(dòng)物模型的建立。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周雌性BALB/c小鼠, 體質(zhì)量18～22 g, 購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。生產(chǎn)合格證號(hào)：[SCXK(川)2015-030]。

1.2 主要試劑與儀器

卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)購于美國Sigma公司；氫氧化鋁膠體購于美國Thermo Pierce公司；蘇木素-伊紅染液購于北京索萊寶科技有限公司；瑞氏染液購于美國Sigma公司；多段編程人工氣候箱購于寧波江南儀器廠，壓縮空氣霧化器購于O2BOX有限公司。

1.3 方法

1.3.1模型制備:48只SPF級(jí)6～8周雌性BALB/c小鼠，購回后使用無卵蛋白飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)數(shù)字法分為4組：正常對(duì)照組(A)：12只，置于溫度為(21±1)℃，相對(duì)濕度為(50±5)%的正常環(huán)境飼養(yǎng)；哮喘模型組(B)：12只，正常環(huán)境飼養(yǎng)下，用卵清蛋白(OVA)進(jìn)行激發(fā)和致敏；高濕組(C)：12只，置于溫度為(21±1)℃，相對(duì)濕度為(90±5)%的高濕環(huán)境與正常環(huán)境下交替飼養(yǎng)12 h；高濕哮喘組(D)：12只，高濕環(huán)境與正常環(huán)境交替飼養(yǎng)12 h，用OVA進(jìn)行激發(fā)和致敏。OVA的激發(fā)和致敏：B、D組每只小鼠在飼養(yǎng)第1、8天腹腔注射含OVA 50 μg、氫氧化鋁凝膠1 mg的生理鹽水0.2 mL。第15天將小鼠置于密閉容器中用含1% OVA的生理鹽水霧化激發(fā)60 min，每天一次，連續(xù)1周制備急性哮喘模型。以呼吸急促深快、煩躁嗆咳及點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)等癥狀的出現(xiàn)為激發(fā)成功，A、C組以普通生理鹽水代替以上所有操作。記錄小鼠的日常行為學(xué)變化和體質(zhì)量變化。

1.3.2小鼠血常規(guī)檢測(cè)：小鼠以2%戊巴比妥鈉45 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，摘眼球取4～5滴血液置于抗凝管中，輕輕搖勻備用，最后進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。

1.3.3肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類：處死小鼠，頸部去毛消毒，剪開分離氣管，穿繩，氣管剪小口用8號(hào)灌胃針插入并打死結(jié)，0.8 mL預(yù)冷的PBS進(jìn)行肺泡灌洗，反復(fù)抽吸三次，重復(fù)兩次。加入等體積 4%多聚甲醛于4 ℃固定20～30 min，2 500 r/min 5 min，4 ℃離心，去上清，下層細(xì)胞加入100 μL PBS 重懸細(xì)胞后涂片，自然晾干，瑞氏染色后，中性樹膠封片，使用普通光學(xué)顯微鏡觀察4組肺泡灌洗液細(xì)胞涂片，在40倍物鏡視野內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3.4小鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)：取下小鼠全心肺組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定至少24 h。在脫水機(jī)中脫水后石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。制成玻片觀察組織病理變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

A組小鼠行為狀態(tài)良好，反應(yīng)敏捷，飲水正常，毛發(fā)潔白有光澤，糞便干燥成形；B、D組在致敏期和霧化期毛發(fā)明顯暗淡不光滑，霧化期結(jié)束后出現(xiàn)煩躁嗆咳的行為；C、D組致敏霧化期糞便軟爛不成形。造模結(jié)束后，C、D組小鼠體質(zhì)量明顯下降，與A組、B組相比有顯著性差異(P<0.05)。(表1)

表1 小鼠體質(zhì)量變化Table 1 The weight change of mice (g,

注：與A組相比，①P<0.05，與B組相比，②P<0.05

Note： Compared with group A,①P<0.05; Compared with group B,②P<0.05

2.2 肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類

使用普通光學(xué)顯微鏡觀察4組肺泡灌洗液細(xì)胞涂片，與A組相比，C組淋巴細(xì)胞增多(P<0.05)，B、D組淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞大量增多(P<0.05)，D組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量多于B組(P<0.05),見圖1，表2。

2.3 小鼠血常規(guī)分析

高濕環(huán)境下，小鼠血液處于水腫狀態(tài)，紅細(xì)胞腫脹。與A組相比，B、C、D組紅細(xì)胞(RBC)數(shù)量有顯著性增多(P<0.05)，C、D組紅細(xì)胞比積(HGT)上升(P<0.05)，D組平均血紅蛋白濃度和含量均下降(P<0.05)，而D組紅細(xì)胞寬度標(biāo)準(zhǔn)差顯著高于其他3組(P<0.05)，粒細(xì)胞百分比含量和粒細(xì)胞絕對(duì)值均明顯下降，見表3。

2.4 小鼠肺組織病理學(xué)變化

A組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，小支氣管完整，管腔光滑，肺泡間隔正常，基本無炎癥細(xì)胞浸潤；B、D組小鼠小支氣管水腫，黏膜基底層增厚，管腔狹窄；B組肺泡間隔增厚明顯，C組小鼠小支氣管管壁增厚及管腔狹窄的程度均輕，B、C、D組小鼠肺泡間隔均有出血現(xiàn)象，見圖2。

表2 肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 2 Bronchoalveolar lavage and detection

注：與A組相比，①P<0.05，與B組相比，②P<0.05，與C組相比，③P<0.05

Note： Compared with group A,①P<0.05; Compared with group B,②P<0.05; Compared with group C,③P<0.05

圖1 小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞涂片F(xiàn)ig.1 The smear of mice alveolar lavage fluid

圖2 小鼠肺組織病理學(xué)變化Fig.2 Pathological changes of lung tissue in mice

表3 小鼠血常規(guī)指標(biāo)結(jié)果Table 3 Results of blood routine index in

注：與A組相比，①P<0.05，與B組相比，②P<0.05，與C組相比，③P<0.05

Note： Compared with group A,①P<0.05; Compared with group B,②P<0.05; Compared with group C,③P<0.05

3 討論

近年來，臨床發(fā)現(xiàn)高濕環(huán)境對(duì)哮喘的發(fā)生發(fā)展有一定影響。目前開展的高濕環(huán)境條件與哮喘等疾病相關(guān)的研究大多局限于流行病學(xué)調(diào)查，沒有明確的實(shí)驗(yàn)證據(jù)揭示高濕環(huán)境誘導(dǎo)或加劇哮喘的機(jī)制。以人類為研究對(duì)象探討高濕環(huán)境對(duì)哮喘的影響存在眾多限制，目前已經(jīng)有穩(wěn)定的哮喘模型，但高濕環(huán)境下的哮喘模型尚無研究，因此建立高濕環(huán)境下穩(wěn)定的哮喘動(dòng)物模型十分必要。目前高濕哮喘模型的建立主要存在3個(gè)問題：①穩(wěn)定的高濕環(huán)境的形成；②同時(shí)適合高濕和哮喘模型需求的動(dòng)物種類；③高濕哮喘模型建立成功的指標(biāo)性數(shù)據(jù)。

高濕環(huán)境對(duì)濕度穩(wěn)定要求高，而環(huán)境因素對(duì)BALB/c小鼠的生長有不同影響，需要嚴(yán)格控制環(huán)境條件[4]，因此本實(shí)驗(yàn)使用人工模擬多段編程氣候箱，精密調(diào)節(jié)環(huán)境溫度、濕度和光照[5]。鑒于動(dòng)物倫理學(xué)考慮，采用相對(duì)濕度為95%和50%日夜交替飼養(yǎng)，使用無卵蛋白飼料正常飲食飲水，小鼠在95%環(huán)境下毛發(fā)暗淡濕潤，對(duì)飲水訴求減少，覓食行為減少，但沒有出現(xiàn)死亡個(gè)例。肺組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)哮喘組、高濕組、高濕哮喘組大部分小鼠產(chǎn)生肺出血現(xiàn)象。已有文獻(xiàn)表明OVA致敏激發(fā)后哮喘小鼠會(huì)出現(xiàn)肺組織淤血，伴有紅色斑點(diǎn)[6]，而高濕組小鼠可能是由于長期生活在高濕度的小空間氣候模擬箱中，箱內(nèi)微生物繁殖加快，致病菌增多可能導(dǎo)致肺部感染，產(chǎn)生肺出血現(xiàn)象，這需要我們后續(xù)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

哮喘是多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的氣道慢性炎癥性疾病[7]，哮喘發(fā)病的傳統(tǒng)關(guān)鍵機(jī)制是Th1/Th2相關(guān)細(xì)胞因子失衡[8-9]。已經(jīng)證實(shí)OVA誘導(dǎo)形成的哮喘模型為Th2型哮喘模型，通過嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量、相關(guān)細(xì)胞因子變化和肺部病理變化可以判斷小鼠哮喘是否成功造模[10-12]。經(jīng)典哮喘模型中BALB/c小鼠對(duì)OVA敏感性強(qiáng)，易造模成功，文獻(xiàn)記述，雌性小鼠哮喘模型穩(wěn)定性更高[13]，且性格溫順，體質(zhì)量穩(wěn)定，可能更適合在高濕環(huán)境下飼養(yǎng)，因此，本實(shí)驗(yàn)采用雌性BALB/c小鼠進(jìn)行造模。高濕環(huán)境下氧氣含量降低水分含量過高，小鼠可能表現(xiàn)出呼吸不順，煩躁不暢，組織腫脹，炎癥加重等現(xiàn)象，對(duì)哮喘的治愈和改善有抑制作用。但高濕環(huán)境對(duì)模型產(chǎn)生的影響目前仍是通過前文提及的哮喘疾病的指標(biāo)判斷，還沒有具體的指標(biāo)性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。而高濕環(huán)境對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的影響很可能是通過水轉(zhuǎn)運(yùn)和缺氧狀態(tài)實(shí)現(xiàn)的，后續(xù)研究中可從相關(guān)通路中尋找穩(wěn)定的高濕指標(biāo)。