李曉娟 張巧云 湯紫榮 馮 帆 孫慧偉 李 潤 李瑞生

(1. 解放軍第302醫(yī)院臨床研究管理中心，北京 100039)(2. 山東省蓬萊市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，蓬萊 265600) (3. 解放軍第302醫(yī)院疾病預(yù)防控制科，北京 100039)

遺傳突變是自然突變動物模型建立的重要途徑之一。由于遺傳基因突變誘導(dǎo)所致突變系小鼠的表型特征比較多樣化，部分表現(xiàn)在外觀體征變異，部分則表現(xiàn)為器官異常甚至功能發(fā)生異常[1]。BALB/c卷毛小鼠是本實(shí)驗(yàn)室在BALB/c小鼠繁殖過程中發(fā)現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠，本實(shí)驗(yàn)室通過回交和近交培育以及對其種子資源進(jìn)行了純化，現(xiàn)已繁殖20代。我們的前期研究結(jié)果也提示突變基因?qū)π∈蟮拿庖咂鞴僖约把簩W(xué)指標(biāo)都有一定的影響[2-3]，同時有研究者已經(jīng)對其他類型的突變小鼠的免疫細(xì)胞以及免疫功能進(jìn)行了分析研究[4]，因此本實(shí)驗(yàn)對BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠的血常規(guī)免疫細(xì)胞指標(biāo)、血清免疫球蛋白和補(bǔ)體以及與免疫相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測，對比分析兩組小鼠各指標(biāo)之間是否存在差異，旨在探討突變基因是否對小鼠的免疫功能造成一定的影響，為進(jìn)一步探討B(tài)ALB/c突變卷毛小鼠的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

BALB/c突變卷毛小鼠來源于本實(shí)驗(yàn)室近交培育(全同胞兄妹交配)的群體，選擇6周齡BALB/c卷毛小鼠20只(雌雄各10只)；同時選擇6周齡BALB/c小鼠20只(雌雄各10只)，來源于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，許可證號[SCXK(京)2016-0002]，所有小鼠均為清潔級動物。本實(shí)驗(yàn)室具有SPF級實(shí)驗(yàn)動物使用許可證書[SYXK(軍)2017-0010]。飼養(yǎng)室溫度22～23 ℃，相對濕度50%，自由進(jìn)食和飲水，實(shí)驗(yàn)方案通過了本醫(yī)院倫理委員會的審查。

1.2 試劑盒和儀器設(shè)備

KX-21 N全自動血球分析儀(日本Sysmex公司)；5415R離心機(jī)(Eppendoff公司)；Model680型酶標(biāo)儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)，全自動酶標(biāo)洗板機(jī)(BioTek)，小鼠白介素-2(IL-2)ELISA試劑盒(CSB-04627 m，規(guī)格:48T)；小鼠白介素-4(IL-4)ELISA試劑盒(CSB- E04634m，規(guī)格: 48T)；小鼠腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(CSB- E04741m，規(guī)格:48T)。試劑盒均購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1血液免疫指標(biāo)測定：從小鼠尾部采血20 μL，用全自動血細(xì)胞分析儀檢測以下血常規(guī)指標(biāo)：中性粒細(xì)胞百分比(NE)、中性粒細(xì)胞絕對值(NE#)、淋巴細(xì)胞百分比(LY)、淋巴細(xì)胞絕對值(LY#)、單核細(xì)胞百分比(MO)、單核細(xì)胞絕對值(MO#)6項(xiàng)指標(biāo)。

1.3.2血清免疫球蛋白和補(bǔ)體測定：兩組小鼠禁食過夜，用毛細(xì)采血管于眼眶后靜脈叢采血1～2 mL，置于EP管中。將血液室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，分離血清，從血清中取出50 μL用于檢測細(xì)胞因子，剩余血清送檢驗(yàn)科檢測指標(biāo)：免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體C3(C3)。

1.3.3血清細(xì)胞因子IL-2、IL-4、TNF-α的測定：采用上述分離的50 μL血清，采用ELISA法，按試劑盒說明書方法操作，酶標(biāo)儀450 nm處檢測吸光度A值，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-2、IL-4、TNF-α水平。上述所有實(shí)驗(yàn)操作均符合動物福利原則。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠血液免疫細(xì)胞指標(biāo)分析

結(jié)果顯示：兩組小鼠的NE、NE#和MO雌性及組間結(jié)果比較具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，兩組小鼠雌性的LY相比具有顯著性差異(P<0.05)，其它各項(xiàng)指標(biāo)無差異(表1)。

2.2 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠血清抗體和補(bǔ)體分析

結(jié)果顯示：兩組小鼠IgM的性別及組間結(jié)果比較具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)，兩組小鼠IgG和C3的雄性及組間結(jié)果比較具有顯著性差異(P<0.01)，其它各項(xiàng)指標(biāo)無差異(表2)。

表1 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠血液免疫細(xì)胞的比較Table 1 The contrast of blood immune cells betweenBALB/c mutant curly mouse and BALB/c

注：動物數(shù)為雌雄各10只，與正常BALB/c小鼠比較：*P<0.05，**P<0.01.

Note：10 male and 10 female mice each，compared with normal BALB/c mice*P<0.05，**P<0.01.

表2 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠血清抗體和補(bǔ)體指標(biāo)的比較Table 2 The contrast of antibody and complement betweenBALB/c mutant curly mouse and BALB/c

注：動物數(shù)為雌雄各10只，與正常BALB/c小鼠比較：*P<0.05，**P<0.01。

Note：10 male and 10 female mice each，compared with normal BALB/c mice*P<0.05，**P<0.01.

2.3 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠血清細(xì)胞因子分析

結(jié)果顯示：兩組小鼠IL-4雌性及組間結(jié)果相比具有顯著性差異(P<0.05)，其它各項(xiàng)指標(biāo)無差異(見表3)。

表3 BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/c小鼠血清細(xì)胞因子指標(biāo)的比較Table 3 The contrast of serum cell factors betweenBALB/c mutant curly mouse and BALB/c

注：動物數(shù)為雌雄各10只，與BALB/c小鼠比較：*P<0.05

Note：10 male and 10 female mice each，compared with BALB/c mice*P<0.05

3 討論

目前報道有140多個影響被毛及毛發(fā)結(jié)構(gòu)的基因，其中研究最多的是裸基因和無毛基因，無毛基因可表達(dá)于皮膚，也可表達(dá)于機(jī)體的多個部位[5]。同時研究表明突變小鼠由于攜帶無毛基因后，其T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均會表現(xiàn)功能缺陷，而突變基因還會隨著小鼠的成長影響胸腺等免疫器官的結(jié)構(gòu)及功能[6]。王冬平等[7]對無毛小鼠的胸腺和淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)突變小鼠的胸腺萎縮且淋巴細(xì)胞稀疏。史崇敏等[8]對無毛小鼠與有毛小鼠的免疫器官及功能進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)在免疫組織學(xué)以及免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子方面均存在顯著性差別。而目前國內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)突變卷毛小鼠品系的有關(guān)情況，本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的BALB/c卷毛小鼠也未曾對其免疫細(xì)胞以及細(xì)胞因子進(jìn)行對比分析。

因此，本實(shí)驗(yàn)選取6周齡BALB/c突變卷毛小鼠和BALB/c小鼠，對其血液免疫細(xì)胞、血清抗體補(bǔ)體以及血清細(xì)胞因子進(jìn)行了相應(yīng)的測定分析，結(jié)果顯示：BALB/c突變卷毛小鼠血液的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞顯著低于BALB/C小鼠，此結(jié)果提示突變基因可能造成了血液中免疫細(xì)胞的減少。本實(shí)驗(yàn)的血液抗體檢測結(jié)果顯示：兩組小鼠IgA的結(jié)果未發(fā)現(xiàn)差異具有顯著性，IgA在黏膜免疫中發(fā)揮著重要的抗病毒作用，能將病毒吸附到黏膜上皮細(xì)胞從而筑起第一道防線[9]，因此提示BALB/c卷毛小鼠的皮膚在預(yù)防外界病毒方面的功能與BALB/c小鼠不具有差異。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BALB/c卷毛小鼠IgM、IgG和C3顯著低于BALB/c小鼠，IgM為體液免疫出現(xiàn)最早的抗體，通常將IgM作為判斷感染的指標(biāo)[10]。IgG可以中和毒素和病毒，還能夠調(diào)理吞噬細(xì)胞的吞噬作用[11]。因此提示BALB/c卷毛小鼠可能在感染早期和對抗外毒素以及吞噬病毒作用方面的能力均低于BALB/c小鼠。目前研究表明IL-2是機(jī)體內(nèi)最主要的T細(xì)胞生長因子[12]，TNF-α可增強(qiáng)IL-2依賴的胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞增殖能力，同時TNF-α有明顯的促炎活性和免疫調(diào)節(jié)作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BALB/c卷毛小鼠的IL-2、TNF-α與BALB/c小鼠不存在差異，提示BALB/c卷毛小鼠與BALB/c小鼠在促炎方面可能不存在差異。而由T淋巴細(xì)胞亞群分泌的IL-4能夠增強(qiáng)殺傷性T細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性[14-15]。而BALB/c卷毛小鼠的IL-4顯著低于BALB/c小鼠，提示BALB/c卷毛小鼠的淋巴細(xì)胞殺傷性作用可能略低于BALB/c小鼠。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示突變基因?qū)π∈蟮拿庖吖δ墚a(chǎn)生了影響，降低了卷毛小鼠對外源物質(zhì)的清除能力，和機(jī)體的抗病毒和吞噬能力，推測此BALB/c卷毛小鼠可能為腫瘤移植實(shí)驗(yàn)提供良好的動物模型。下一步我們將利用此BALB/c卷毛小鼠進(jìn)行腫瘤移植方面的研究，以期能夠?yàn)榕R床研究提供良好的小鼠腫瘤模型。

綜上所述， 本實(shí)驗(yàn)初步對BALB/c突變卷毛小鼠的血液免疫學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了檢測分析，旨在發(fā)現(xiàn)BALB/c突變卷毛小鼠與BALB/C小鼠之間存在的差異以及差異程度，結(jié)果顯示卷毛小鼠的免疫功能出現(xiàn)了減弱的現(xiàn)象，為BALB/c突變卷毛小鼠的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了基礎(chǔ)資料。