張東輝 薛曉玉 謝 志 唐 軍 李建瑛 許 琴是文輝 李佳佳 董 翔 馬 娜 宋來陽(yáng) 劉江偉

(新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

肌纖維類型最早發(fā)現(xiàn)于1673年，Loranzini 認(rèn)為動(dòng)物骨骼纖維有紅色與白色之分；隨后，Ranvier 在 1883 年正式提出紅色的骨纖肌(簡(jiǎn)稱紅肌)和白色的骨纖肌(簡(jiǎn)稱白肌)功能 有所不同，并利用電刺激方法證明了這一理論。近期研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)高溫應(yīng)激可以誘導(dǎo)紅肌纖維向白肌纖維轉(zhuǎn)化。對(duì)于在41 ℃干熱環(huán)境中大鼠的骨骼肌是否也會(huì)出現(xiàn)紅肌轉(zhuǎn)化為白肌的熱應(yīng)激反應(yīng)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)姜黃素(curcumin)能夠延長(zhǎng)沙漠干熱環(huán)境中暑大鼠的生存時(shí)間[1]。我們推測(cè)姜黃素在大鼠骨骼肌熱應(yīng)激反應(yīng)中能夠起到一定作用。本次研究主要觀察在姜黃素作用下沙漠干熱環(huán)境中大鼠骨骼肌組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)的變化，為姜黃素在干熱環(huán)境中暑的防治應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供6～8周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠200只，體質(zhì)量220～260 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)[SCXK(新)2011-0001]。大鼠自購(gòu)入后于新疆軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科SPF環(huán)境獨(dú)立通氣籠中適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度25 ℃，相對(duì)濕度45%，飼料經(jīng)輻照處理，飲水經(jīng)高溫滅菌處理，大鼠自由攝食和飲水。

1.2 儀器與試劑

西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)、全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司,BS-180)、電子稱(上海儀器廠，精確度:0.1 g、量程:1 000 g)、分析天平(上海儀器廠，精確度:0.1 mg、量程:220 g)、BI2000醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。姜黃素(東京化工業(yè)株式會(huì)社，天然物(CI-75300))、羧甲基纖維素鈉(上海源葉生物科技有限公司，300-800mpa.s)，肌紅蛋白測(cè)定試劑盒(北京利得曼生化技術(shù)有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：201501071)

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

將200只健康雄性大鼠隨機(jī)分為5組： ①對(duì)照組(鹽水組)：正常飼喂，不做預(yù)處理；②羧甲基纖維素鈉溶劑組(溶劑組)：用5 g羧甲基纖維素鈉+蒸餾水定容到1 000 mL配成0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液；③姜黃素低劑量預(yù)處理組：用姜黃素5 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液④姜黃素中劑量預(yù)處理組：用姜黃素10 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，⑤姜黃素高劑量預(yù)處理組：用姜黃素20 mg/100 g+0.5%羧甲基纖維素鈉溶液。以上各組按照1 mL/100 g體質(zhì)量灌胃，連續(xù)灌胃7 d，1次/d。

1.4 模型建立及取材方法

特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙內(nèi)將沙漠干熱環(huán)境設(shè)定為(41±0.5)℃，相對(duì)濕度(10±1)%，大鼠進(jìn)艙前，禁食12 h，可隨意飲水。大鼠進(jìn)艙后禁食禁水，不麻醉，可在籠內(nèi)自由活動(dòng)。按0 min、50 min、100 min、150 min時(shí)間點(diǎn)從艙中取出大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉，麻醉大鼠，剪開腹腔，下腔靜脈采血，用于肌紅蛋白檢測(cè)；取部分股二頭肌置于4%中性甲醛液中固定、脫水、包埋、切片、HE染色、普通顯微鏡下觀察，描述組織病理變化；于50 min、150 min由鹽水組、姜黃素高濃度組大鼠股二頭肌中取1 mm×1 mm×1 mm組織塊置于鋨酸中固定、脫水、浸透、包埋、切片、染色、透射電鏡觀察。

1.5 肌紅蛋白檢測(cè)方法

肌紅蛋白檢測(cè)使用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行測(cè)定，具體參數(shù)按試劑盒要求設(shè)定。

1.6 灰度測(cè)量方法

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 干熱環(huán)境鹽水組、姜黃素高濃度組大鼠骨骼肌組織學(xué)觀察

鹽水組、姜黃素高濃度組0 min時(shí)肌纖維染色均勻，部分肌纖維橫紋不清晰，肌纖維側(cè)面細(xì)胞核排列整齊，核仁清晰，有少量肌纖維部分區(qū)域呈灰紅色，此區(qū)域橫紋較為清晰，與周圍相比兩側(cè)胞核數(shù)量較多(圖1 A,B)。50 min鹽水組肌肉縱切面紅肌變淡，部分呈片集中分布，部分散在分布于紅肌中(圖1C)；姜黃素高濃度組部分紅肌局部顏色變淡，且分布較為分散(圖1D)。100 min鹽水組肌肉縱切面同一根肌纖維中仍保持部分紅肌，部分呈現(xiàn)白肌且顏色明顯變淡，同一視野下轉(zhuǎn)化白肌的肌纖維數(shù)量明顯增多(圖1E)；姜黃素高濃度組肌肉縱切面同一根肌纖維中局部出現(xiàn)白肌，但顏色仍呈現(xiàn)淡紅色，同一視野下轉(zhuǎn)化白肌的肌纖維數(shù)量相對(duì)較少(圖1F)。150 min鹽水組肌肉縱切面肌纖維中白肌比例明顯增高，只有少部分肌纖維邊緣含有紅色(圖1G)；姜黃素高濃度組肌肉縱切面轉(zhuǎn)化白肌的肌纖維數(shù)量有所增多，但顏色仍呈現(xiàn)淡紅色(圖1H)；150 min鹽水組肌肉橫切面肌束中多數(shù)肌纖維呈現(xiàn)白色，只有肌束邊緣少數(shù)肌纖維保持紅色(圖1I)；姜黃素高濃度組肌肉橫切面肌束中間部分肌纖維顏色變淡，肌束邊緣多為紅色肌纖維(圖1J)。

圖1 干熱環(huán)境大鼠骨骼肌組織學(xué)變化注：A, 0 min鹽水組;B, 0 min姜黃素高濃度組;C, 50 min鹽水組;D,50 min姜黃素高濃度組;E, 100 min鹽水組;F, 100 min姜黃素高濃度組;G, 150 min鹽水組;H, 150 min姜黃素高濃度組;I, 150 min鹽水組肌肉橫切面;J, 150 min姜黃素高濃度組肌肉橫切面Fig.1 Histological changes of rats skeletal muscle in dry heat environmentNote:A, 0 min saline group;B, 0 min high dose curcumin pretreatment group;C, 50 min saline group;D, 50 min high dose curcuminpretreatment group;E, 100 min saline group; F, 100 min high dose curcumin pretreatment group; G, 150 min saline group;H, 150 min high dose curcumin pretreatment group; I, 150 min saline group (transverse section of muscle);J, 150 min high dose curcumin pretreatment group(transverse section of muscle)

2.2 干熱環(huán)境鹽水組、姜黃素高濃度組大鼠骨骼肌電鏡觀察

在干熱環(huán)境50 min時(shí)鹽水組骨骼肌肌纖維中部分線粒體濃縮變小甚至消失，線粒體數(shù)量明顯減少，Z線排列較為整齊；(圖2A)姜黃素高濃度組骨骼肌肌纖維中部分線粒體濃縮變小甚至消失，局部線粒體數(shù)量有所減少，但在肌纖維邊緣部分區(qū)域線粒體堆集，有增生跡象(圖2B)。在干熱環(huán)境150 min時(shí)鹽水組骨骼肌肌纖維中線粒體數(shù)量非常少，部分Z線排列不整齊，胞核膜和核仁較為清晰(圖2C)；姜黃素高濃度組骨骼肌肌纖維中部分線粒體濃縮變小甚至消失，部分線粒體腫脹模糊，局部線粒體數(shù)量有所減少，但在肌纖維部分區(qū)域線粒體堆集，有增生跡象，部分Z線排列不整齊(圖2D)。以上結(jié)果表明干熱環(huán)境鹽水組以線粒體減少為主要組織學(xué)改變；姜黃素高濃度組線粒體與鹽水組相比減少數(shù)量較少，另外無論在干熱環(huán)境50 min還是150 min均可見線粒體堆集的增生跡象。

圖2 干熱環(huán)境大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)變化注：A，50 min鹽水組；B，50 min姜黃素高濃度組；C，150 min鹽水組；D，150 min姜黃素高濃度組Fig.2 Ultrastructural changes of rats skeletal muscle in dry heat environmentNote: A，50 min saline group; B，50 min high dose curcumin pretreatment group; C，150 min saline group;D，150 min high dose curcumin pretreatment group

2.3 干熱環(huán)境大鼠血液中肌紅蛋白含量的測(cè)定

結(jié)果顯示干熱環(huán)境大鼠血液中肌紅蛋白含量各組比較相差不顯著(P>0.05)。說明未出現(xiàn)肌纖維破裂而導(dǎo)致肌紅蛋白進(jìn)入血液中導(dǎo)致血液中濃度增高的現(xiàn)象，表明肌纖維完整性較好。見表1.

表1 干熱環(huán)境大鼠血液中肌紅蛋白(ng/mL)測(cè)量結(jié)果Table 1 Measurement of myoglobin (ng/mL) in theblood of rats in dry heat environment

2.4 姜黃素對(duì)干熱環(huán)境大鼠骨骼肌白肌含量的影響

鹽水組和溶劑組，從0 min到150 min，灰度值逐漸升高，150 min明顯高于0 min組(P<0.05)，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0 min除外)，隨著姜黃素濃度增加，灰度值均呈下降趨勢(shì)，在50 min組差異無顯著性(P>0.05)，在100 min和150時(shí)，姜黃素中、高濃度組灰度值較溶劑組和鹽水組差異明顯，具有顯著性差異(P<0.05)。

表2 干熱環(huán)境大鼠骨骼肌白肌灰度測(cè)量結(jié)果Table 2 Measurement of gray scale of rats skeletal musclein dry heat environment

注： 150 min中濃度組、高濃度組與鹽水組和溶劑組比較★P<0.05；100 min中濃度組、高濃度組與鹽水組和溶劑組比較※P<0.05；鹽水組0 min與150 min比較，*P<0.05)；溶劑組0 min與150 min比較，#P<0.05。

Note： At dry heat 150 min, medium and high dose curcumin group compared with saline and solvent group,★P<0.05；At dry heat 100 min, medium and high dose curcumin group compared with saline and solvent group,※P<0.05；In the saline group, Omin group compared with 150 min group *P<0.05; In the solvent group, Omin group compared with 150 min group#P<0.05

3 討論

骨骼肌是人和動(dòng)物軀體的重要組成部分，根據(jù)骨骼肌肌纖維顏色的不同，將其分為紅肌與白?。欢鶕?jù)骨骼肌肌纖維收縮特性 將其分為慢肌與快?。辉谶@種分類方法中，紅肌實(shí)際上對(duì)應(yīng)于慢肌，白肌對(duì)應(yīng)于快肌。根據(jù)肌球蛋白 ATP 酶在不同酸堿環(huán)境中活性的差異，可將骨骼肌肌纖維分為 I、IIa、IIb 三種類型[2-3]，其中I型對(duì)應(yīng)紅色的慢?。籌I型對(duì)應(yīng)于白色的快肌。I 型纖維含有豐富的線粒體，表現(xiàn)出氧化代謝功能；II 型纖維含有的線粒體較少，但糖原酵解能力強(qiáng)。骨骼肌肌纖維類型并不是一成不變，它們會(huì)在一定條件下發(fā)生轉(zhuǎn)變。其中高溫應(yīng)激可誘導(dǎo)Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化[4-6]。本次研究發(fā)現(xiàn)在干熱環(huán)境中隨著時(shí)間延長(zhǎng)鹽水組、溶劑組、低濃度組大鼠骨骼肌紅肌減少，白肌增多(P<0.05)，而且白肌肌纖維橫紋清晰、結(jié)構(gòu)完整，肌纖維中線粒體明顯減少，未發(fā)現(xiàn)肌纖維損傷和炎性細(xì)胞，同時(shí)血液中肌紅蛋白含量未見明顯變化(P>0.05)，表明本次研究中大鼠骨骼肌紅肌減少，白肌增多是一種生理改變的現(xiàn)象，這是高溫應(yīng)激誘導(dǎo)的結(jié)果。值得注意的是姜黃素干預(yù)組的中濃度組和高濃度組大鼠骨骼肌紅肌未見明顯減少，白肌未見明顯增多(P>0.05)，肌纖維中線粒體數(shù)量降低較少，局部有線粒體堆集增生的跡象。表明經(jīng)過姜黃素預(yù)處理后，在高溫應(yīng)激反應(yīng)中能夠抑制Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維的轉(zhuǎn)化。

近期在肌纖維類型轉(zhuǎn)化研究中發(fā)現(xiàn)過氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子(peroxisome proliferators-activated receptorγcoactivator 1alpha，PGC-1α)和AIMP1(ARS-interacting multifunctional protein 1, AIMP1)又稱 p43 蛋白，均能夠促進(jìn)Ⅰ型肌纖維(紅肌)類型屬性的形成[7-9]，并且發(fā)現(xiàn)PGC-1α和AIMP1在骨骼肌中高度表達(dá)，參與了能量代謝、線粒體合成、肌纖維轉(zhuǎn)換等[10-11]。本次研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過姜黃素預(yù)處理后，姜黃素高濃度組線粒體與鹽水組相比減少數(shù)量較少，另外無論在干熱環(huán)境50 min還是100 min均可見線粒體堆集增生跡象；我們?cè)谇捌谘芯恐幸舶l(fā)現(xiàn)經(jīng)過姜黃素預(yù)處理后的大鼠在干熱環(huán)境中肝臟、腎臟的線粒體損傷較小，形態(tài)較為完整[12-13]；另外在藥效研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)姜黃素具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用，而氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，甚至腫瘤的產(chǎn)生都與細(xì)胞線粒體損傷有關(guān)。這些研究結(jié)果表明姜黃素對(duì)細(xì)胞線粒體具有一定的保護(hù)作用。那么姜黃素是直接作用于細(xì)胞線粒體還是間接的通過對(duì)PGC-1α和AIMP1之類有利于線粒體保護(hù)的因子起作用還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，本研究中姜黃素預(yù)處理可以減少干熱環(huán)境骨骼肌從紅肌轉(zhuǎn)向白肌的數(shù)量，并對(duì)骨骼肌線粒體的減少具有一定的抑制作用，骨骼肌白肌可能是骨骼肌應(yīng)激狀態(tài)的代償狀態(tài)，伴隨無氧酵解能力的增強(qiáng)。但隨著應(yīng)激因素的持續(xù)作用最終可能超出代償能力而發(fā)生橫紋肌溶解，本組中沒有發(fā)現(xiàn)骨骼肌溶解，肌紅蛋白不高，可能因?yàn)楦蔁岘h(huán)境的大鼠處于靜止?fàn)顟B(tài)，沒有附加勞力型運(yùn)動(dòng)等應(yīng)激因素，勞力型熱射病常發(fā)生在熱環(huán)境下作業(yè)和軍事及體育運(yùn)動(dòng)者，橫紋肌溶解常常是勞力型熱射病的過程中導(dǎo)致多臟器功能障礙的重要因素[14]，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠穩(wěn)定骨骼肌線粒體數(shù)量，阻止骨骼肌代償?shù)氖Ш鉅顟B(tài)。因此我們推測(cè)，姜黃素預(yù)處理可能在對(duì)于干熱環(huán)境下勞力型熱射病并發(fā)的橫紋肌溶解及繼發(fā)的多臟器功能障礙具有一定的抑制作用，在臨床上具有重大的應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步探索和研究。