高艷芳，王楠， 王雨雪，肖強(qiáng)

(1. 生物資源保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000；2. 湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院，湖北 恩施 445000)

樟科(Lauraceae)潤(rùn)楠屬(MachilusNees)植物，主要分布在亞洲東南部和東部熱帶、亞熱帶地區(qū)，約有100種，中國(guó)是其分布中心，記載有68種3變種，集中分布于長(zhǎng)江以南各省(區(qū))。潤(rùn)楠屬植物是我國(guó)南方主要的經(jīng)濟(jì)林木，大部分種類(lèi)是熱帶及亞熱帶森林的表征種，在園林綠化、藥用、木材以及香料生產(chǎn)等方面占有重要地位[1-2]。潤(rùn)楠(Machiluspingii)是國(guó)家Ⅱ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，其樹(shù)干挺直，具廣闊的傘狀樹(shù)冠，木材細(xì)致，味芳香，為優(yōu)良的行道樹(shù)及庭院綠化樹(shù)種，莖、葉、皮均可入藥。我們前期研究木蘭科植物多樣性過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，潤(rùn)楠葉中具有較高過(guò)氧化物酶活性。

過(guò)氧化物酶(Peroxidase.POD.EC.1.11.1.7)是廣泛存在于各種動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi)發(fā)揮清除過(guò)氧化氫作用的重要酶類(lèi)[3-4]。因其本身結(jié)構(gòu)的特殊性以及對(duì)環(huán)境的友好性，目前，POD已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域[5]。尤其是利用POD催化處理廢水中低濃度、有雌激素效應(yīng)的酚類(lèi)化合物的方法引起了人們的廣泛興趣，進(jìn)而在相關(guān)技術(shù)上進(jìn)行了有效的探索[6-10]。例如對(duì)大豆POD(Soybean peroxidase，SBP)用于酚類(lèi)物質(zhì)清除的條件優(yōu)化、動(dòng)力學(xué)特性和反應(yīng)機(jī)理研究[11]，充分展現(xiàn)了POD對(duì)水體中微量酚類(lèi)污染物的清除具有的較好應(yīng)用前景。

環(huán)境雌激素是一類(lèi)通過(guò)干擾生物體自身激素的分泌、合成、代謝進(jìn)而影響機(jī)體正常生命活動(dòng)的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)，具有隱蔽性、遷移性、蓄積性、持久性等特點(diǎn)，作用機(jī)制復(fù)雜、影響范圍廣泛，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康和生存[12]。雙酚A(BispHenol A,BPA)化學(xué)名稱(chēng)2,2-二(4-羥基苯基)丙烷，又名二酚基丙烷，主要應(yīng)用于生產(chǎn)聚碳酸酯、環(huán)氧樹(shù)脂、聚砜樹(shù)脂、聚苯醚樹(shù)脂、不飽和聚酯樹(shù)脂等，是一種具有雌激素活性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是世界生產(chǎn)量最大的化工原料之一，因其具有無(wú)色透明、耐用、輕便和防沖擊性特性，廣泛應(yīng)用于液體容器、食品包裝及各類(lèi)醫(yī)療設(shè)備等[13]。但BPA在使用過(guò)程中會(huì)從材料中釋放、泄漏出來(lái)，分布在大氣、土壤和水環(huán)境中，通過(guò)水和食物進(jìn)入動(dòng)物和人體內(nèi)，并結(jié)合細(xì)胞中的激素受體，引起內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，致使有機(jī)體出現(xiàn)多種機(jī)能障礙，危害人類(lèi)健康，其毒性研究已經(jīng)受到學(xué)者的高度關(guān)注[14]。Li等人發(fā)現(xiàn)，接觸過(guò)多的BPA可能引發(fā)肥胖癥[15]。Ahmadkhaniha等人研究證實(shí)，尿液中含有BPA越多，發(fā)生糖尿病的概率就越高[16]。Chapalamadugu等人研究表明，BPA會(huì)干擾胎兒心臟的相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄，可能會(huì)引發(fā)一系列的心臟疾病[17]。日前，也有研究表明BPA可以增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的造血細(xì)胞的癌變和誘發(fā)睪丸腫瘤[18]，進(jìn)一步的研究還證實(shí)BPA在小鼠身上表現(xiàn)為惡性乳腺癌致癌物質(zhì)，并可能對(duì)人類(lèi)也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的結(jié)果[19]。BPA無(wú)處不在，即使是低劑量染毒，也會(huì)造成嚴(yán)重的損傷；BPA具有生物富集、效用持久以及生理學(xué)響應(yīng)濃度極低等特性，致使其在環(huán)境水體中很難通過(guò)傳統(tǒng)水處理技術(shù)去除。當(dāng)前，對(duì)環(huán)境中BPA的消除主要采用生物降解法[20]、光催化的化學(xué)降解法[21]、活性炭吸附法[22]以及生物酶降解法[23]等方法，基于生物酶降解法具有高效、綠色、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。

為研究潤(rùn)楠成熟葉POD對(duì)環(huán)境水體中的污染物BPA的清除效果及實(shí)際應(yīng)用前景，充分利用綠色資源，我們對(duì)潤(rùn)楠成熟葉POD進(jìn)行了初步分離，得到性質(zhì)穩(wěn)定的粗酶液，在此基礎(chǔ)上考察該酶對(duì)水體中的BPA去除效果及反應(yīng)最佳條件。旨在探索一種利用POD處理含BPA廢水的低成本途徑，同時(shí)最大限度開(kāi)發(fā)潤(rùn)楠葉用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以湖北民族學(xué)院人工栽植的20年齡潤(rùn)楠(Machiluspingii)，湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院易詠梅教授鑒定，成熟葉為試驗(yàn)原料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 潤(rùn)楠POD粗提。取潤(rùn)楠成熟葉，除去葉柄、主脈，稱(chēng)取700g。按照1∶6料液比加入提取液進(jìn)行提取，提取液含2%聚乙烯吡咯烷酮(PVP-P)、20%硫酸銨(W/V)以及20%的聚乙二醇(PEG2000(W/V))，4℃勻漿，置于冷凍離心機(jī)4℃、5000r/min離心45min，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中靜置萃取2 h，取下相(鹽相)，再次離心，條件同上，進(jìn)一步抽濾，濾渣丟棄，濾液轉(zhuǎn)移至透析袋中，采用蒸餾水透析除鹽，每8 h更換一次水，直至透析液用1% BaCl2檢測(cè)無(wú)沉淀產(chǎn)生為止(一般在有磁力攪拌器攪拌的情況下，更換3次蒸餾水即可達(dá)到除鹽效果)。脫鹽后的酶液冷凍干燥保存待用。

1.2.2 POD酶活性測(cè)定。參考Amako[24]等的方法并稍修改，測(cè)定體系為4mL，包括1mL 40mmol/L愈創(chuàng)木酚，1mL 40mmol/L H2O2，1.9mL 100mmol/L Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(pH 6.0)。加入0.1mL酶液后啟動(dòng)反應(yīng)，于波長(zhǎng)470nm，30 ℃下記錄OD值變化。1個(gè)酶活性單位定義為測(cè)定條件下每分鐘OD470變化0.1所需的酶量。

1.2.3 蛋白含量測(cè)定。蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用 Bradford[25]染色法，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.3 BPA去除條件研究

研究最佳酶濃度時(shí)，檸檬酸緩沖液(50mmol/L，pH值6)，0.2 mg/mL的BPA溶液(后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用此濃度)、100μmol/L H2O2，反應(yīng)溫度25 ℃，設(shè)置酶濃度分別為50、100、150、200、300、500U/mL，之后對(duì)其它去除條件的研究，除變量外均采用此條件。研究最佳溫度時(shí)，設(shè)置不同的反應(yīng)溫度分別為10、15、20、25、30、40、60℃恒溫水浴條件下，對(duì)BPA清除效果展開(kāi)研究。設(shè)定pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、11.0的檸檬酸緩沖液(50mmol/L)，對(duì)BPA清除效果展開(kāi)研究。設(shè)定粗酶液與H2O2摩爾濃度比為1∶0.5、1∶2、1∶5、1∶7.5、1∶12、1∶20，潤(rùn)楠粗酶液對(duì)BPA清除效果研究。反應(yīng)混合物置于恒溫水浴鍋中攪拌，加入1mL H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，反應(yīng)體系共20 mL。于反應(yīng)0min(未加過(guò)氧化氫時(shí))、1、3、5、15、45、90、120、180min取1mL反應(yīng)溶液，加入2mL甲醇終止反應(yīng)，即實(shí)現(xiàn)潤(rùn)楠葉對(duì)BPA的清除。加入100μL硫酸鋁鉀以終止反應(yīng)，搖勻，過(guò)夜沉淀后5000 g離心10min。上清液過(guò)0.22μm濾膜后檢測(cè)BPA濃度。

1.4 分析方法

Agilent公司ZORBAX C-18(2.1×50mm, 1.8μm)色譜柱。流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，35%乙腈等度洗脫，柱溫25℃，體積流量0.2mL/min。ESI離子源負(fù)模式，干燥氣溫度350℃，流速10L/min；霧化器壓力45psig，毛細(xì)管電壓3500 V，毛細(xì)管出口電壓150V，錐孔電壓65V，采集速度1.5spectra/s，選擇離子(EIC)采集方式，選定的分子離子[M -H]-的質(zhì)荷比為227(BPA)。

2 結(jié)果分析

2.1 最佳清除酶濃度確定

分別考察50、100、150、200、300、500U/mL的潤(rùn)楠粗酶液濃度對(duì)BPA清除效果的影響。結(jié)果如圖1所示?？梢?jiàn)在同一時(shí)刻，隨著反應(yīng)體系酶濃度的升高，BPA最終剩余率不斷下降，在20min時(shí)，50U/mL酶濃度清除效果可達(dá)60%，500U/mL可達(dá)到完全清除。在90min左右大于50U/mL的任意酶濃度去除BPA的效率達(dá)99%以上。由此可以看出，潤(rùn)楠POD對(duì)于催化去除BPA效果極佳，具有良好的應(yīng)用前景。

圖1 不同酶濃度對(duì)潤(rùn)楠葉過(guò)氧化物酶清除BPA的影響

2.2 不同溫度條件對(duì)去除BPA的影響

分別在10、15、20、25、30、40、60℃條件下，考察溫度對(duì)潤(rùn)楠POD催化去除BPA的影響，結(jié)果如圖2所示。可見(jiàn)溫度對(duì)于酶清除BPA影響較小，在短時(shí)間內(nèi)均可達(dá)到高效清除。在10～60℃范圍內(nèi)3 h清除率可以達(dá)到99%，在25℃時(shí)清除效果極佳，表明該酶的熱穩(wěn)定性良好，有益于實(shí)際運(yùn)用。酶促反應(yīng)對(duì)溫度具有高度敏感性，升高溫度既可加速酶促反應(yīng)又可加速酶的變性失活。上述溫度條件下，潤(rùn)楠POD受溫度影響很小，可在較低溫度和較高溫度下保持活性，具有很好溫度適應(yīng)范圍。

圖2 不同溫度條件對(duì)潤(rùn)楠葉過(guò)氧化物酶清除BPA的影響

2.3 pH對(duì)去除BAP的影響

設(shè)定pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、9.0、11.0的反應(yīng)條件(50mmol/L)，考察不同pH對(duì)去除BPA的影響，結(jié)果如圖3所示?？梢?jiàn)，pH值為4～7之間時(shí)，該酶促反應(yīng)均無(wú)太大影響，在40min左右，對(duì)BPA的清除效果可達(dá)到99%。而pH值超出此范圍時(shí)，pH對(duì)反應(yīng)影響較大， 顯著降低了對(duì)BPA的去除效率。上述結(jié)果表明，在酸性到中性條件下，潤(rùn)楠POD具有良好的活性及穩(wěn)定性，可以有效去除BPA。

圖3 不同pH值條件對(duì)對(duì)潤(rùn)楠葉過(guò)氧化物酶清除BPA的影響

2.4 最佳清除H2O2/BPA摩爾濃度比比值確定

設(shè)定H2O2/BPA摩爾濃度比為1∶0.5、1∶2、1∶5、1∶7.5、1∶12、1∶20，考察不同H2O2/BPA比值對(duì)去除BPA的影響，所得具體結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，在反應(yīng)達(dá)到3 h時(shí)，在H2O2/BPA摩爾濃度比值為5～20時(shí)，BPA未能達(dá)到完全的清除，但均可達(dá)80%及以上。在比值為0.5時(shí)，3 h后清除率僅達(dá)60%，僅當(dāng)H2O2/BPA摩爾濃度比值為2時(shí)，在3 h內(nèi)去除率和去除反應(yīng)速率隨著濃度比的增大而減小，3 h后可完全清除，確定H2O2/BPA最佳摩爾濃度為2倍。

結(jié)果顯示，不同的H2O2/BPA摩爾濃度比比值，對(duì)去除BPA有明顯的區(qū)別。主要因?yàn)镠2O2既是POD的底物又是POD的失活劑。劉海峰等研究表明，H2O2作為氧化劑，其初始反應(yīng)濃度的高低直接影響對(duì)底物的催化反應(yīng)效果，H2O2的濃度小于20mM時(shí)，最終產(chǎn)物濃度與底物OPD濃度呈正比例關(guān)系，但當(dāng)H2O2的濃度大于20mM時(shí)，最終產(chǎn)物濃度不再與底物OPD濃度呈正比關(guān)系，說(shuō)明此時(shí)過(guò)量的H2O2使HRP發(fā)生了更復(fù)雜的失活作用[26]。

圖4 不同H2O2比例對(duì)潤(rùn)楠葉過(guò)氧化物酶清除BPA的影響

3 結(jié)論與討論

POD是植物體內(nèi)普遍存在的、活性較高的一種酶，它與植物代謝及抗逆性都有密切關(guān)系[27-28]。董金龍等[29]對(duì)金銀花過(guò)氧化物酶酶學(xué)性質(zhì)研究表明，金銀花最適溫度是30℃，且該酶在10～40℃范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，最適pH和pH穩(wěn)定性研究表明酶的最適pH為5，酶在pH小于4的酸性環(huán)境下酶活力下降，pH值在4～7范圍內(nèi)有較好的穩(wěn)定性。在本研究中，潤(rùn)楠葉POD在pH4～7內(nèi)穩(wěn)定性良好，溫度在10～60℃范圍酶活性無(wú)明顯損失。與金銀花POD較為接近，說(shuō)明潤(rùn)楠POD具有優(yōu)良的耐熱性，有利于實(shí)際生產(chǎn)利用。

Duarte-Vázquez等[30]等研究了蘿卜過(guò)氧化物酶(TP)對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的清除效果，結(jié)果顯示，在pH4～8，溫度25℃，H2O2濃度為0.8mmol/L條件下，經(jīng)過(guò)3 h，1.28U/LTP對(duì)0.5mmol/L對(duì)BPA的清除效果可達(dá)85%，在本研究中，在pH4～7，溫度10～60℃，H2O2/BPA摩爾濃度比比值為2的條件下，經(jīng)過(guò)3h，潤(rùn)楠POD對(duì)0.2 mg/mL BPA清除率可高達(dá)99%及以上。與上述結(jié)果類(lèi)似，潤(rùn)楠POD具有較寬的pH范圍及良好的溫度適應(yīng)性，表明潤(rùn)楠POD具有工業(yè)應(yīng)用的前景。

經(jīng)過(guò)雙水相萃取，從潤(rùn)楠成熟葉片中分離得到一種活性較高、性質(zhì)穩(wěn)定的POD。潤(rùn)楠POD清除BPA的最佳條件為酶濃度為300U/mL ，pH值6，接近中性，溫度25℃ ，H2O2/BPA摩爾濃度之比為2時(shí)，其清除率達(dá) 95% 以上，最高可達(dá)99.9%的去除率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)充分顯示潤(rùn)楠POD具有較寬的pH和溫度適應(yīng)范圍以及較高的去除率和抗有機(jī)污染能力，在酚類(lèi)污染治理方面具有巨大潛力和商業(yè)價(jià)值。

在污水處理及污水循環(huán)利用的過(guò)程中，對(duì)含有BPA在內(nèi)的廢水的控制和清除，是非常緊迫和必要的，酶處理技術(shù)因作為一種綠色經(jīng)濟(jì)有效方法而值得探索研究，利用酶的催化氧化作用處理內(nèi)分泌干擾物污染也是目前受到重視和看好的新興技術(shù)。該技術(shù)可有效降低污水中低濃度有毒有機(jī)污染物，對(duì)篩選更高效經(jīng)濟(jì)的酶具有深遠(yuǎn)意義。