鄭佳琳，黃小紅，饒子亮，梁艷齡，劉驥德，黃小瓊，曾素丹，鄺少松

（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，廣東佛山528248）

目前，放化療作為腫瘤治療的重要手段，其臨床應(yīng)用廣泛。但由于放射線與化療藥物對正常組織細胞與腫瘤細胞的破壞具有無選擇性，故而放化療會導(dǎo)致機體一系列的毒副反應(yīng)。其中，骨髓抑制較為常見，往往是放化療被動減量或停藥的最常見原因。從某種意義上來說，對骨髓抑制的控制是化療成功與否的關(guān)鍵[1]。為了最大限度的殺傷腫瘤細胞，同時又能最大程度減輕化療藥物的毒性作用，快速地恢復(fù)機體的造血功能，造血干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞移植技術(shù)已開始越來越多地用于臨床[2]，骨髓間充質(zhì)干細胞擴增能力強，免疫原性低，多向分化潛能在體內(nèi)外都已得到充分證明，在移植治療肝損傷、心肌梗死、脊髓損傷等產(chǎn)生了良好的治療效果[3]。參芪顆粒具有升白護髓、補氣養(yǎng)血、健脾益腎、增強免疫，適用于腫瘤患者白細胞、紅細胞、血小板減少，貧血等癥，并適用于脾腎虧虛、免疫力低下的治療，具有控制各種腫瘤的復(fù)發(fā)[4]。本研究通過建立小鼠骨髓移植模型，探討骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合參芪顆粒對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)嚴重骨髓損傷小鼠造血功能的影響，為中西醫(yī)結(jié)合治療放化療引起的骨髓抑制提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級BALB/c小鼠，雄性，體重18～22g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心〔SCXK（粵）2013-0002〕。動物飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心SPF級動物房〔SYXK（粵）2013-0002〕。動物飼養(yǎng)條件：5只/箱，群養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度與濕度：20～26℃，40～70%，采用 10h：14h 晝夜間斷照明；飼養(yǎng)室條件始終保持穩(wěn)定，以保證試驗結(jié)果的可靠性。自由進食飲水，飼料和飲用水均由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑與儀器

參芪顆粒、環(huán)磷酰胺（CTX）、重組人粒細胞集落刺激因子注射液（rhG–CSF），細胞周期試劑盒；JEA3001系列電子天平、BCD-5000全自動血液細胞分析儀、BD AccuriC6流式細胞儀。

1.3 細胞培養(yǎng)

體外大量培養(yǎng)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，選擇處于對數(shù)生長期及狀態(tài)良好的細胞進行給藥治療。

1.4 動物造模

將檢疫合格的60只雄性BALB/c小鼠按照體重隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、參芪顆粒組、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組、聯(lián)合用藥組 ，每組10只。除空白對照組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺20 mg·kg-1·d-1，1次/d，連續(xù)7 d，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生骨髓抑制。

1.5 動物給藥

末次給予環(huán)磷酰胺次日，小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組和聯(lián)合用藥組小鼠一次性尾靜脈注射1.0×107個小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞；陽性對照組小鼠腹腔注射 125 μg·kg-1·d-1rhG–CSF，參芪顆粒組和聯(lián)合用藥組小鼠灌胃18.2 g·kg-1·d-1參芪顆粒，空白對照組和模型對照組灌胃給予等量純凈水，每天1次，連續(xù)給藥7天。

1.6 外周血血常規(guī)檢查

分別于實驗第8，10，14天，取尾靜脈血20 μL置于130 μL肝素抗凝稀釋液中，充分混勻。用Mek-7222k型全自動血球計數(shù)儀檢測小鼠外周血白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血紅蛋白、紅細胞壓積和血小板的變化。

1.7 骨髓有核細胞懸液的制備及有核細胞計數(shù)

實驗第14天頸椎脫臼處死各組小鼠，取出右側(cè)股骨，除凈軟組織，用6號針頭以1 mL PBS沖出骨髓細胞，200目篩網(wǎng)過濾后裂解紅細胞，將單個骨髓細胞懸液1000 r/min離心5 min，去上清，用預(yù)冷PBS洗滌2次，棄上清，用PBS定容至5 mL。按白細胞計數(shù)法進行骨髓有核細胞計數(shù)。并計算絕對數(shù)量。

1.8 骨髓有核細胞細胞周期的分析測定

取上述制備好的骨髓單核細胞懸液1000 r/min離心5 min，棄上清，加入70%預(yù)冷乙醇固定打散細胞，4℃固定過夜，用 PBS將上述細胞洗 2次，加100 μL PBS混勻，加PI染液（4℃，避光 30 min），以標準程序用流式細胞儀檢測細胞周期的變化，一般計數(shù)1～2萬個細胞，結(jié)果用軟件FlowJo7.6分析細胞周期。結(jié)果以細胞周期各時相細胞百分率表示，并按以下公式計算細胞增殖指數(shù)(proliferation index,PI)：PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.9 骨髓組織病理學(xué)檢查

取小鼠左側(cè)股骨固定、脫鈣，石蠟切片蘇木精-伊紅染色，觀察股骨骨髓組織形態(tài)學(xué)變化。

1.10 統(tǒng)計方法

實驗所得數(shù)據(jù)用 SPSS 21.0軟件統(tǒng)計，結(jié)果用表示，各組數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，同時進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合參芪顆粒對骨髓抑制小鼠外周血象的影響

與空白對照組比較，實驗第8天，其余各組小鼠外周血中白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細胞壓積值均顯著降低（P＜0.05），證明造模成功。實驗第14天，模型組小鼠的白細胞、淋巴細胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細胞壓積值均有所升高，但仍均顯著低于空白對照組（P＜0.05）。

與模型對照組比較，實驗第10天（即治療第3天），各治療組的白細胞、淋巴細胞、紅細胞、血小板數(shù)和血紅蛋白、紅細胞壓積值均開始升高，到實驗第14天（即治療第7天），逐漸恢復(fù)正常水平；各治療組的白細胞數(shù)目在實驗第10天，白細胞數(shù)目和血紅蛋白在實驗14天均顯著升高（P＜0.05）；參芪顆粒組血小板數(shù)目在實驗第14天顯著升高（P＜0.05）；小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組的血紅蛋白在實驗第10天與紅細胞壓積值在實驗第14天均顯著升高 （P＜0.05）；聯(lián)合用藥組的淋巴細胞、血小板數(shù)目和血紅蛋白在實驗第10天均顯著升高（P＜0.05），血小板數(shù)目和紅細胞壓積值在實驗第14天均顯著升高（P＜0.05）。

與陽性對照組和與參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組的白細胞數(shù)目在實驗第8天、實驗第14天均顯著升高 （P＜0.05），結(jié)果見表1和表2。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓有核細胞的影響

與空白對照組比較，模型對照組小鼠骨髓有核細胞（BMC）數(shù)量顯著降低（P＜0.05）；與模型對照組比較，各治療組均可以顯增加骨髓抑制小鼠的骨髓BMC數(shù)量 （P＜0.05）；與陽性對照組、參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組BMC數(shù)量顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表3。

2.3 骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓細胞周期變化的影響

與空白對照組比較，造模后骨髓細胞細胞周期出現(xiàn)了停滯的狀態(tài)，模型組小鼠G0/G1期細胞顯著增加，S期和G2/M期細胞均顯著減少，細胞增殖指數(shù)（PI）顯著降低（P＜0.05）。

與模型對照組比較，各治療組均能解除 G0/G1期細胞阻滯，促進 G0/G1期細胞進入增殖周期，使S期和G2/M期細胞增加，增加骨髓抑制小鼠骨髓細胞的增殖指數(shù)（P＜0.05）。

與陽性對照組和參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組G0/G1期細胞百分比顯著降低，S期與G2/M期細胞百分百顯著升高 ，細胞增殖指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組比較，聯(lián)合用藥組S期與G2/M期細胞百分百顯著升高，細胞增殖指數(shù)顯著升高（P＜0.05），結(jié)果見表3。

2.4 骨髓間充質(zhì)干細胞聯(lián)合參芪顆粒對骨髓抑制小鼠骨髓組織病理學(xué)的影響

各組小鼠骨髓病理切片見圖A～F?？瞻讓φ战M小鼠骨髓造血細胞比例正常且分布均勻，未見明顯的脂肪組織（圖A）；模型對照組小鼠骨髓腔充滿脂肪組織，出現(xiàn)大量空白區(qū)，造血細胞殘余少量，成熟紅細胞增多（圖B）；陽性對照組（圖C）、參芪顆粒組（圖D）、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組（圖E）、聯(lián)合用藥組（圖F）小鼠的骨髓抑制均有所改善，病理切片可見脂肪細胞明顯減少，造血細胞增生且比例未見異常，成熟紅細胞數(shù)量正常。

表1 各組小鼠白細胞、淋巴細胞與紅細胞的比較（±s，n=10，♂）

表1 各組小鼠白細胞、淋巴細胞與紅細胞的比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，1)P＜0.05；與模型組比較，2)P＜0.05；與陽性對照組比較，3)P＜0.05；與參芪顆粒組比較，4)P＜0.05；與小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組比較，5)P＜0.05。

白細胞數(shù)目（×109/L） 淋巴細胞數(shù)目（×109/L） 紅細胞數(shù)目（×1012/L）d8 d10 d14 d8 d10 d14 d8 d10 d14空白對照組 7.7±0.6 9.3±0.5 10.4±1.4 6.83±1.37 7.10±1.66 7.11±1.80 9.1±0.3 9.1±0.9 8.9±0.9模型對照組 1.9±0.51) 2.2±0.71) 3.9±0.91) 2.34±0.801)3.56±0.831)4.91±1.251) 6.5±0.61) 7.3±0.91) 7.8±1.1陽性對照組 2.2±0.51) 5.0±0.61)2)6.7±0.81)2)2.93±0.921)4.85±1.081)6.05±1.18 6.9±0.81) 7.8±0.71) 8.7±1.2參芪顆粒組 2.1±0.71) 4.6±0.41)2)6.6±0.81)2)3.02±0.941)4.42±0.851)5.95±0.90 6.8±1.11) 7.8±0.41) 8.1±1.2組別小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組 2.2±0.71) 5.6±1.01)2)4)6.8±0.71)2)2.64±0.711)4.88±0.741)6.02±0.94 6.8±0.91) 7.5±1.01) 8.3±1.0聯(lián)合用藥組 2.0±0.61) 6.0±0.91)2)3)4)8.0±0.81)2)3)4)2.84±0.421)5.09±0.881)2) 6.32±0.94 7.0±1.31) 8.1±1.21) 9.0±0.7

表2 各組小鼠的血小板數(shù)目、血紅蛋白與紅細胞壓積值比較（±s，n=10，♂）

表2 各組小鼠的血小板數(shù)目、血紅蛋白與紅細胞壓積值比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，1)P＜0.05；與模型組比較，2)P＜0.05；與陽性對照組比較，3)P＜0.05；與參芪顆粒組比較，4)P＜0.05；與小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組比較，5)P＜0.05。

血小板數(shù)目（×109/L） 血紅蛋白（×109/L） 紅細胞壓積（×1012/L）d8 d10 d14 d8 d10 d14 d8 d10 d14空白對照組 921±102 930±75 973±163 150±3 161±17 154±19 42.3±1.3 41.0±4.6 43.3±3.8模型對照組 536±1161) 652±1051) 748±1481) 86±101) 95±171) 101±161) 33.7±3.61) 35.3±2.01) 38.0±3.01)陽性對照組 513±991) 762±1671) 900±86 89±151) 108±141) 126±221)2)32.8±3.21) 39.0±3.3 42.5±4.0參芪顆粒組 534±1401)741±1631) 918±972) 91±121) 117±61) 125±161)2)31.7±3.41) 38.4±2.0 41.4±2.3組別小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組 549±1541) 798±106 907±101 94±141) 120±201)2)133±172) 30.3±4.71) 39.4±4.9 43.1±3.72)聯(lián)合用藥組 547±1281) 824±922) 953±1162) 88±171) 118±201)2) 143±142) 33.3±4.61) 38.8±5.1 43.2±3.8 2)

表3 各組小鼠骨髓有核細胞數(shù)和細胞周期的比較（±s，n=10，♂）

表3 各組小鼠骨髓有核細胞數(shù)和細胞周期的比較（±s，n=10，♂）

注：與空白對照組比較，1)P＜0.05；與模型組比較，2)P＜0.05；與陽性對照組比較，3)P＜0.05；與參芪顆粒組比較，4)P＜0.05；與小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組比較，5)P＜0.05。

組 別 骨髓有核細胞數(shù)（×106/L） G0/G1（%） S（%） G2/M（%） PI（%）空白對照組 15.33±2.00 54.76±2.85 34.22±2.29 11.32±1.08 45.41±1.96模型對照組 5.48±1.131) 72.48±1.881) 22.55±1.771) 6.05±0.751) 28.28±1.751)陽性對照組 11.68±1.062) 65.55±2.451)2) 24.12±2.601) 8.27±1.061)2) 33.05±2.531)2)參芪顆粒組 11.73±1.822) 66.50±2.771)2) 23.86±2.371) 8.07±0.451)2) 32.41±1.081)2)小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞組 12.26±0.971)2) 65.00±2.461)2) 25.06±1.371) 8.44±0.471)2) 34.02±1.521)2)聯(lián)合用藥組 13.83±1.422)3)4) 61.90±3.181)2)3)4) 29.36±3.471)2)3)4)5) 9.84±0.771)2)3)4)5) 38.72±1.891)2)3)4)5)

3 討論

環(huán)磷酰胺是臨床上常用的抗腫瘤藥物，主要用于血液系統(tǒng)及各種實體腫瘤的治療[5]。但是由于環(huán)磷酰胺是一種細胞周期非特異性細胞毒藥物[6]，在抑制腫瘤細胞增殖的過程中也會影響正常細胞的增殖與分化，從而引起骨髓抑制等諸多不良反應(yīng)。

骨髓間充干細胞具有高增殖和多向分化潛能，易于采集、分離純化和體外擴增，在細胞治療、基因治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。近年來證實，骨髓間充干細胞除具有促進造血干細胞移植后造血重建外，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，防治移植物抗宿主病[7]。

參芪顆粒主要成分是黨參和黃芪，黨參有益氣、養(yǎng)津、補血作用，黃芪有補氣升陽、護衛(wèi)固表作用。研究表明，黃芪能促進人骨髓細胞中紅細胞系和粒細胞系祖細胞的生成[8]，并在臨床用于治療白細胞減少癥中被證實有顯著療效[9]；黨參有增加紅細胞、血紅蛋白和白細胞的作用[10]。參芪顆粒藥效與骨髓抑制的病癥相類似，且中藥配方顆粒可滿足臨床辨證論治，隨癥加減的需要，同時服用方便，保持和發(fā)揚了傳統(tǒng)中醫(yī)藥的特點和優(yōu)勢，既有利于中藥質(zhì)量的規(guī)范化，亦有利于中藥的標準化和國際化。

圖A～F各組小鼠骨髓病理切片HE染色（×400）

有研究表明，參芪液在體外可以誘導(dǎo)成人骨髓間質(zhì)干細胞分化為神經(jīng)元樣細胞[11]。本研究觀察了小鼠骨髓間充干細胞聯(lián)合參芪顆粒對小鼠骨髓抑制模型的造血功能的影響，結(jié)果表明，與模型對照組比較，參芪顆粒與小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞單獨使用均具有一定改善骨髓抑制小鼠的造血機能，促進骨髓造血細胞進入細胞增殖周期，提高細胞增殖率和造血細胞比例的作用，但小鼠骨髓間充干細胞聯(lián)合參芪顆?？梢赃_到更好的效果。與陽性對照組和參芪顆粒組比較，聯(lián)合用藥組小鼠外周血白細胞數(shù)和骨髓有核細胞數(shù)明顯恢復(fù)，G0/G1期細胞比例降低，S期、G2/M期細胞比例升高，細胞增殖指數(shù)升高。以上結(jié)果提示，小鼠骨髓間充干細胞聯(lián)合參芪顆粒能夠拮抗環(huán)磷酰胺對骨髓細胞的抑制作用，提高骨髓細胞的增殖和外周血象，促進造血功能恢復(fù)，有利于緩解骨髓抑制病征。