宋文 何魯江

目前，一般檢測鹽酸克侖特羅的快速診斷試劑條采用的方法是膠體金檢測法，該方法雖然能滿足快速現(xiàn)場檢測的要求，但是只能定性判斷樣品的陰、陽性，而時(shí)間分辨微球檢測試劑條可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場的快速定量檢測。時(shí)間分辨熒光微粒是將鑭系稀土元素Eu3+、Tb3+等填入高分子納米微粒內(nèi)制成。將其用于免疫分析中，則是將蛋白共價(jià)交聯(lián)在納米微球表面的化學(xué)基團(tuán)上，通過免疫反應(yīng)和待檢物結(jié)合，通過測定熒光強(qiáng)度來推算待檢物的濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陽性尿樣、陰性尿樣、時(shí)間分辨微球（長沙特優(yōu)異）、酪蛋白、Tris、BSA、Borax等化學(xué)試劑（購自Sigma）。鹽酸克侖特羅單克隆抗體、鹽酸克侖特羅BSA偶聯(lián)物（購自杭州隆基生物）。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)（湘儀）、超聲波細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝）、旋轉(zhuǎn)混合儀（寧波新芝）、時(shí)間分辨讀卡儀（蘇州和邁）。

1.3 方法

1.3.1 鹽酸克侖特羅的標(biāo)記時(shí)間分辨微球

1.3.1.1 配置標(biāo)記使用的緩沖液

Buffer A：50mM MES溶液（pH6.0）;

Buffer B：0.23% Tris+0.25% casein（pH8.0）;

Buffer C：0.76% Borax（pH9.0） ;

Buffer D：0.76% Borax+0.25% Casein。

1.3.1.2 微球標(biāo)記抗體

①100μL直徑200nm的時(shí)間分辨微球，原始濃度1%（W/V），稀釋到900μL Buffer A中;

②15000rpm離心20min，去上清;

③加入1000μL Buffer A，使用移液槍吹打混勻;

④15000rpm離心20min，去上清;

⑤加入1000μL Buffer C，超聲2min（功率30%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定10℃寧波新芝JY92-IIN，2號變幅桿）;

⑥配置50mg/mL EDAC溶液（使用純化水溶解），配置50mg/mL NHS溶液（使用純化水溶解），以上溶液現(xiàn)配現(xiàn)用。

⑦在稀釋、超聲好的1000μL微球溶液（0.1%W/V）中加入10μL EDAC溶液以及20μL NHS溶液，震蕩混勻（旋渦混勻器）5min后，再用旋轉(zhuǎn)混勻儀旋轉(zhuǎn)混勻25min（室溫條件）;

⑧15000rpm離心20min，去上清;

⑨加入1000μL Buffer C，使用移液槍吹打混勻后超聲2min（功率65%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

⑩15000rpm離心20min，去上清;

?加入700μL Buffer C，使用移液槍吹打混勻后超聲2min（功率65%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

?使用Buffer C稀釋需要標(biāo)記的蛋白（抗體0.1mg、重組抗原0.2mg），在旋轉(zhuǎn)混勻儀旋轉(zhuǎn)混勻2h（室溫條件）;

?加入100μL Buffer D，旋渦震蕩勻混2min，在旋轉(zhuǎn)混勻儀旋轉(zhuǎn)混勻30min（室溫條件）;

?15000rpm離心15min，去上清;

?加入1000μL Buffer B使用移液槍吹打混勻，超聲1min（功率30%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

?15000rpm離心15min，去上清;

?加入1000μL Buffer B使用移液槍吹打混勻，超聲1min（功率30%，超聲5s，間歇5s，溫度設(shè)定25℃）;

?超聲完畢的微球保存在2～8℃冰箱中。

1.3.2 試紙的制作

將標(biāo)記好的微球抗體使用Buffer B稀釋100倍，分裝于反應(yīng)杯中（每個(gè)反應(yīng)杯裝量300μL），并進(jìn)行鋁塑封膜。該組件作為檢測抗體反應(yīng)液體。將鹽酸克侖特羅BSA偶聯(lián)物劃膜在硝酸纖維素膜（賽多利斯CN140）上，使用濃度為0.2mg/mL;質(zhì)控線包被濃度為1.0mg/mL羊抗鼠多抗，兩者的劃膜噴量為1.0μL/mL。按照正常組裝方式分別將PVC塑料底板、硝酸纖維素膜（25mm）、空氣濾膜（17mm）黏貼組裝。

1.3.3 試紙條檢測

將鹽酸克侖特羅使用陰性尿樣稀釋，建立梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度值分別為0.25ppb、0.5ppb、1ppb、2ppb、4ppb、8ppb、16ppb、32ppb。

使用反應(yīng)杯自帶的10μL采樣頭分別吸取不同濃度值的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品，插入到反應(yīng)杯中顛倒混勻5次，并滴加3滴混合液到試紙條的加樣孔中，每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品重復(fù)10個(gè)測試，一個(gè)80個(gè)測試。計(jì)時(shí)5min后將試劑條放入時(shí)間分辨讀卡儀中檢測原始信號值。并記錄相應(yīng)結(jié)果，并進(jìn)行曲線擬合。

2 結(jié)果與討論

使用OriginPro 8擬合軟件計(jì)算擬合曲線以及分析相關(guān)系數(shù)，

計(jì)算模型使用：y=A2+（A1-A2）/（1+（x/x0）^p）。

計(jì)算賦值如下：

A1：229.43258;A2：0.04056;X0：0.02722;P：1.06004;

擬合曲線R2為0.99。

3 結(jié)語

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明時(shí)間分辨熒光的理化性質(zhì)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①由于Eu3+等被納米微粒包裹，消除了在水溶液中熒光淬滅的危險(xiǎn)（Eu3+在水中不穩(wěn)定）;

②由于每個(gè)納米微粒里可以包裹上萬個(gè)Eu3+，因而能放大免疫反應(yīng)效果;

③應(yīng)用在免疫分析中，操作更加簡便：只需要共價(jià)交聯(lián)時(shí)間分辨熒光微粒和抗原抗體，在免疫反應(yīng)后無需加入解離增強(qiáng)液便可讀數(shù)。

與膠體金等傳統(tǒng)的快診方法相比，時(shí)間分辨微球法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①可準(zhǔn)確定量;

②定量檢測范圍更寬，信噪比更高;

③分析的靈敏度高——時(shí)間分辨熒光免疫層析分析儀的檢測器采用的是PMT光電倍增管，比起傳統(tǒng)儀器用的硅光電池的靈敏度更高;

④精密度高——傳統(tǒng)的試紙條由5部分構(gòu)成，吸水墊+NC膜+結(jié)合墊+樣品墊+濾血片;而時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條則是由3部分構(gòu)成，吸水墊+NC膜+多功能濾膜，因而CV值更小，精密度更高。