張海燕，柳陳堅(jiān)，何樹芬，李曉然

（昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500）

葉酸是一種由喋啶、對氨基苯甲酸 （paminobenzoic acid，pABA）和1個(gè)或多個(gè)谷氨酸結(jié)合而成的水溶性B族維生素[1]，由H.K.Mitchell等首次從菠菜葉中分離純化而來，并由此得名[2]。對人類而言，益生菌來源的葉酸，有著安全性高、吸收效果好、無毒副作用等優(yōu)勢，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是人體胃腸道的益生菌群，不僅具有維持腸道菌群平衡，降低膽固醇水平，提高機(jī)體免疫力等多種功能[3-6]，且具有很強(qiáng)的產(chǎn)葉酸能力[7-10]。植物乳桿菌可以作為開發(fā)富含葉酸功能性食品的理想菌種，但是相關(guān)的應(yīng)用研究仍然較少。

葉酸的檢測方法眾多，最早使用的是傳統(tǒng)的微生物法，該法是在1943年Stokstad等發(fā)現(xiàn)富含葉酸的肝臟和酵母浸提物對鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus） 和乳酸鏈球菌 （Streptococcus lactis，S.lactis）的生長狀況產(chǎn)生影響的情形下誕生的，具有實(shí)驗(yàn)周期長，工作量大，重復(fù)性差等缺點(diǎn)[11-12]。其他的一些檢測方法，如同位素放射免疫法，氣相色譜-質(zhì)譜連用檢測，克隆酶供體免疫測定法（CEDIA）[13]等，也因存在著各種缺陷，均未得到廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜法（HPLC），能較好地檢測不同形式的葉酸，且不會受到食品中酶類的影響[14-15]。

篩選高產(chǎn)葉酸的植物乳桿菌，用于酸奶和發(fā)酵大豆的制作，進(jìn)而選出富含葉酸的發(fā)酵食品。這樣的發(fā)酵食品在為機(jī)體提供益生菌和葉酸的同時(shí)，也能抑制其他潛在致病菌的生長、延長食品儲存時(shí)間；發(fā)酵食品可以不需烹飪直接食用，降低了葉酸的損失率[16-17]。本研究選用高效液相色譜法，對34株植物乳桿菌的葉酸合成能力進(jìn)行檢測，從中挑選出三株高產(chǎn)葉酸的菌株，對這三株菌株參與發(fā)酵的酸奶、發(fā)酵大豆的葉酸含量進(jìn)行評定，選出能夠?qū)嶋H推廣應(yīng)用的富含葉酸的發(fā)酵食品，為植物乳桿菌發(fā)酵葉酸的工業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

34株植物乳桿菌均是由本課題組從云南省傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離獲得（見表1），按1.0×109cfu/mL濃度保存于-80℃冰箱中，作為實(shí)驗(yàn)菌種[16，18-20]。

表1 34株乳桿菌來源Table 1 Sources of 34 LAB

MRS 肉湯培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20.0；蛋白胨10.0；牛肉膏 8.0；酵母浸膏 4.0；Tween-80 1 mL；KH2PO42.0；CH3COONa 5.0；C6H5O7（NH4）32.0；MgSO4·7H2O 0.2；MnSO4·4H2O 0.05，蒸餾水定容，調(diào)pH 至 6.5±0.2。

NB培養(yǎng)基（g/L）：結(jié)晶乙酸鈉 5；牛肉粉 3；蛋白胨 10，蒸餾水定容。

FACM培養(yǎng)基：Folic Acid Casei Medium，葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，BD，英國。

去pABA FACM培養(yǎng)基：活性炭處理酪蛋白胰酶消化物 10.0 g；右旋糖 40.0 g；乙酸鈉 40.0 g；磷酸氫二鉀 1.0 g；磷酸二氫鉀 1.0 g；DL-色氨酸 0.2 g；L-門冬酰胺 0.6 g；L-鹽酸半胱氨酸 0.5 g；硫酸腺嘌呤 10.0 mg；鹽酸鳥嘌呤 10.0 mg；尿嘧啶 10.0 mg；黃嘌呤 20.0 mg；聚山梨醇80 0.1 g；谷胱甘肽（還原型） 5.0 mg；硫酸鎂 0.2 g；氯化鈉 20.0 mg；硫酸亞鐵 20.0 mg；硫酸錳 15.0 mg；核黃素 1.0 mg；維生素b6 4.0 mg；維生素 b1 400.0 μg；泛酸鈣 800.0 μg；煙酸 800.0 μg；生物素 20.0 μg；抗壞血酸鈉 500 mg；加適量蒸餾水溶解后，定容至1 L。

1.2 主要儀器

LC-15C高效液相色譜（HPLC）,日本島津國際貿(mào)易公司產(chǎn)品；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱，5 μm，4.6×250 μm，安捷倫公司產(chǎn)品；SK5200HP 超聲波清洗器 ，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

HPLC儀器條件：色譜柱（Agilent Eclipse XDBC18，5 μm，4.6×250 μm）；檢測波長：254 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃；洗脫條件：0～30 min，100%磷酸緩沖液，30～70 min，50%的甲醇水溶液。

1.3 方法與步驟

1.3.1 產(chǎn)葉酸植物乳桿菌的初步篩選 將-80℃冷凍保存的植物乳桿菌取出并迅速解凍，將細(xì)胞濃度為1×109cfu/mL的菌液接種至滅菌MRS肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫靜止培養(yǎng)18 h后，吸取1 mL菌液于2 mL離心管中，5 000 r/min、4℃，離心25 min后，棄上清液，往離心管中先加1 mL的生理鹽水，漩渦震蕩混勻后再離心，如此反復(fù)3次離心洗滌，最后將菌體稀釋100倍，按每5 mL FACM培養(yǎng)基中接種50 μL菌液比例，將菌體的100倍稀釋液接種于5 mL FACM培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)18 h，反復(fù)5次洗滌與接種工作。

1.3.2 HPLC法檢測植物乳桿菌葉酸產(chǎn)量

1）樣品前處理。將長勢良好菌株的FACM培養(yǎng)液，于50 mL的離心管中，5 000 r/min、4℃，離心25 min，取上清液，冷凍干燥后作為葉酸檢測用。

2）葉酸的HPLC檢測

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

準(zhǔn)確稱取0.01 g葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞97%，精確到小數(shù)點(diǎn)后四位），加入10 mL氫氧化鉀溶液，充分溶解后，加蒸餾水定容至1 L得10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。 分別配制成質(zhì)量濃度為 0.25、0.5、1.0、2 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將這4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)分析，以葉酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，在0～2 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)繪制葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）葉酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC檢測

向每個(gè)冷凍干燥樣品管中加1 mL無菌水，充分溶解后，0.45 μm水系濾膜過濾除去雜質(zhì)，用于上機(jī)分析，所用流動相及有機(jī)溶劑需在上機(jī)前超聲脫氣30 min，以除去溶液內(nèi)的氣體，防止溶劑內(nèi)的氣泡堵塞管道和色譜柱。

1.3.3 pABA對植物乳桿菌葉酸產(chǎn)量的影響 配制不同pABA質(zhì)量濃度的FACM培養(yǎng)基，研究pABA質(zhì)量濃度對Lb.Plantarum JH-M1-30葉酸產(chǎn)量的影響。選取6個(gè)pABA質(zhì)量濃度的FACM培養(yǎng)基（ 分 別 為 0，10，20，30，40，60 mg/L），將 Lb.Plantarum JH-M1-30 37℃靜置培養(yǎng)24 h。取1 mL菌液，12 000 r/min，4 ℃，離心 15 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后上機(jī)檢測。

1.3.4 高產(chǎn)葉酸植物乳桿菌的應(yīng)用研究

1）植物乳桿菌的菌種活化及洗滌

各取 30 μL Lb.plantarum SP8-7，Lb.plantarum JH-M1-6-30和Lb.plantarum YML4-3的菌液，接種至5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h；按每5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中接種50 μL菌液比例，將3株植物乳桿菌菌液分別接種于5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)24 h。按同樣的比例將培養(yǎng)液分別接種到50 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng) 24 h，7 000 r/min、4℃， 離心 20 min，棄上清液，往離心管中先加少量生理鹽水吹打菌體懸浮后，再定容至50 mL，漩渦震蕩混勻后再離心，如此反復(fù)3次離心洗滌，最后加5 mL生理鹽水，懸浮菌體待用。

2）酸奶、發(fā)酵大豆的制作

（1）酸奶的制作

取上述菌懸液1 mL分別接種于100 mL的純奶中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后，置于4℃冰箱后發(fā)酵。

（2）發(fā)酵大豆的制作

將4份溫水浸泡過夜的120 g大豆，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌40 min，取出一份作為空白對照，各取1 mL的上述菌懸液分別接種于另外3份大豆中，攪拌均勻后，37℃培養(yǎng)24 h，置于4℃冰箱后發(fā)酵。

3）酸奶和發(fā)酵大豆葉酸產(chǎn)量檢測

（1）樣品前處理

酸奶前處理：分別稱取5 g經(jīng)Lb.plantarum SP8-7，Lb.plantarum JH-M1-6-30 和 Lb.plantarum YML4-3發(fā)酵前后的純奶和酸奶，置于50 mL離心管中，加5 mL磷酸鹽保護(hù)液和5 mL甲醇，150 r/min震蕩4 h后，100℃煮沸5 min，離心后取上清液于燒杯中，70℃水浴15 min，使甲醇揮發(fā)完全，最后冷凍干燥備用。

發(fā)酵大豆前處理：Lin等[21]用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液作為保護(hù)劑添加人類血漿之后煮沸15 min來處理牛奶樣品后檢測葉酸含量。本試驗(yàn)在上述方法的基礎(chǔ)上對樣品進(jìn)行處理。具體步驟如下：分別取適量的發(fā)酵前后的大豆樣品，液氮研磨成粉末狀，各取1 g粉末于50 mL的離心管中，分別加5 mL磷酸鹽保護(hù)液和5 mL甲醇，150 r/min震蕩4 h后，100℃煮沸5 min，離心后取上清液于燒杯中，70℃水浴15 min，使甲醇揮發(fā)完全，隨后冷凍干燥備用。

（2）HPLC 上機(jī)檢測

往上述冷凍干燥后的樣品中各加1 mL蒸餾水，溶解均勻后，用0.45 μm水系膜過濾，過濾后上機(jī)檢測，流動相為體積分?jǐn)?shù)8%甲醇水溶液。樣品上機(jī)檢測完成后，換用體積分?jǐn)?shù)8%甲醇水溶液將管道以及色譜柱中原有磷酸鹽緩沖液置換出來，再用100%甲醇溶液沖柱子，待基線平行后，換100%乙腈沖柱子（30 min以上），以保護(hù)色譜柱。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有樣品上機(jī)檢測3次，將所得峰面積作為Y值代入葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式中計(jì)算X值，所得X值即為葉酸值，每個(gè)樣品得到3個(gè)葉酸值，求平均值后即是樣品的葉酸質(zhì)量濃度。繪圖并標(biāo)出相應(yīng)的誤差線或標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)葉酸菌株的初步篩選

34株植物乳桿菌在FACM培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 h后，觀察植物乳桿菌的生長情況，若長勢良好，初步認(rèn)定其具有葉酸合成能力，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。反之，則不具備葉酸合成能力，因?yàn)镕ACM是嚴(yán)格的去葉酸培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中沒有葉酸，而細(xì)菌生長需要葉酸，只有自身能合成葉酸的菌株才能在FACM中生長，無葉酸合成能力的植物乳桿菌不能在FACM培養(yǎng)基上生長。結(jié)果顯示，34株植物乳桿菌均能很好地生長，初步判斷這34株植物乳桿菌都能產(chǎn)生葉酸。迄今為止，曾報(bào)道過的能產(chǎn)葉酸的乳酸菌并不多，主要屬于雙歧桿菌屬 （Bifidobacterium）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和乳球菌屬 （Lactococus），其中乳球菌屬中 L.lactisssp cremoris CM22和L.lactisssp lactis CM28是最早發(fā)現(xiàn)具有葉酸合成能力的乳酸菌，但產(chǎn)量較低[22-25]。

2.2 葉酸的HPLC檢測

2.2.1 色譜行為 葉酸HPLC分析結(jié)果如圖1和2所示，圖1為質(zhì)量濃度2 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜圖，出峰時(shí)間為21.08 min，峰形均勻且分離程度良好。圖2為樣品HPLC色譜圖。從圖2可以看出這種檢測方法可用于葉酸的檢測。

圖1 HPLC法檢測葉酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜Fig.1 Chromatogram of folate standard by HPLC

圖2 HPLC法洗脫樣品中葉酸色譜Fig.2 Chromatogram of sample by HPLC

2.2.2 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 通過對4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC檢測分析，以葉酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，并標(biāo)出葉酸的定量直線方程和R2值，如圖3所示。如圖所示R2=0.999，R=0.999 49，達(dá)到了R大于3個(gè)9的要求，定量直線方程為y=12.688x-0.035 8。

圖3 葉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of folate by HPLC

2.2.3 FACM培養(yǎng)植物乳桿菌的葉酸產(chǎn)量的HPLC檢測 將34株植物乳桿菌的培養(yǎng)液離心后取上清液，用于HPLC檢測，檢測結(jié)果見圖4，植物乳桿菌葉酸質(zhì)量濃度在0.2～1.5 μg/mL之間，其中LC5-1菌株的葉酸質(zhì)量濃度最低，為 0.264 μg/mL；Lb.plantarum SP8-7的葉酸質(zhì)量濃度最高，達(dá)到1.492 μg/mL， 此外，Lb.plantarum JH-M1-6-30 和Lb.plantarum YML4-3的葉酸產(chǎn)量僅次于SP8-7，分別達(dá)到1.36 μg/mL和1.312 μg/mL。 上述3株植物乳桿菌均具有高產(chǎn)葉酸的能力，故將其應(yīng)用于富含葉酸發(fā)酵食品的研究中。

圖4 樣品葉酸質(zhì)量濃度Fig.4 Folate content of sample

2.3 底物pABA對Lb.plantarum JH-M1-6-30葉酸產(chǎn)量的影響

Lb.plantarum JH-M1-6-30經(jīng)不同pABA質(zhì)量濃度濃度的FACM培養(yǎng)后，所得上清液葉酸含量見圖5，當(dāng)pABA質(zhì)量濃度為0時(shí)，Lb.plantarum JHM1-6-30葉酸產(chǎn)量最低，pABA質(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，葉酸產(chǎn)量達(dá)到最大值，為1.203 μg/mL?？傮w來看，葉酸產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢。Lb.plantarum JH-M1-6-30葉酸產(chǎn)量隨pABA增加而先增加，到達(dá)峰值后降低，說明在一定范圍內(nèi)添加pABA能有效增加葉酸產(chǎn)量，過量的pABA反而會抑制植物乳桿菌產(chǎn)葉酸。

2.4 純奶和大豆發(fā)酵前后葉酸含量的測定結(jié)果

2.4.1 純奶發(fā)酵前后葉酸含量的測定結(jié)果 利用HPLC檢測方法對 Lb.plantarum SP8-7，Lb.plantarum JH-M1-6-30和Lb.plantarum YML4-3發(fā)酵的酸奶和未發(fā)酵的純奶的上清液中的葉酸進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果以葉酸質(zhì)量濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)，以純奶和酸奶編號為橫坐標(biāo)作圖，得出3株菌發(fā)酵純奶前后的葉酸變化，如圖6所示。從圖6中可以看出純奶經(jīng)發(fā)酵后葉酸質(zhì)量濃度比發(fā)酵前高出很多。原料奶中葉酸質(zhì)量濃度為0.021 2 μg/mL，經(jīng)YML4-3發(fā)酵的酸奶中葉酸質(zhì)量濃度較高，是發(fā)酵前的30多倍，其次是Lb.plantarum JH-M1-6-30，雖然Lb.plantarum SP8-7是3株菌中葉酸產(chǎn)量最低的，但和發(fā)酵前的純奶相比，仍能高出20倍以上。Crittenden等[26]利用B.animalis CSCC1941和S.thermophiles CSCC 2000發(fā)酵脫脂乳后其葉酸產(chǎn)量提高了6倍。與之相比，Lb.plantarum在高產(chǎn)葉酸的乳酸菌發(fā)酵酸奶的應(yīng)用中，具有更加廣闊的市場前景。

圖5 pABA對Lb.plantarum JH-M1-6-30葉酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Influence of pABA on folate production by Lb.plantarum JH-M1-6-30

圖6 植物乳桿菌發(fā)酵前后奶的葉酸質(zhì)量濃度Fig.6 Folate content of milk before and after Lb.plantarum fermentation

2.4.2 大豆發(fā)酵前后葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定結(jié)果 通過對使用 Lb.plantarum SP8-7，Lb.plantarum JHM1-6-30和Lb.plantarum YML4-3發(fā)酵大豆和原料大豆中葉酸含量進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果中以葉酸濃度（μg/g）為縱坐標(biāo)，以原料大豆和發(fā)酵大豆編號為橫坐標(biāo)作圖，從而得出原料大豆發(fā)酵前后的葉酸變化，如圖7所示。Lb.plantarum JH-M1-6-30和Lb.plantarum YML4-3發(fā)酵后葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)反而顯著低于原料大豆，原料大豆葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.375 μg/g，原料大豆經(jīng)Lb.plantarum JH-M1-6-30發(fā)酵后，葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)幾乎減少了一半。經(jīng)Lb.plantarum YML4-3發(fā)酵后葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)也減少了近1/3，而經(jīng)Lb.plantarum SP8-7發(fā)酵后的發(fā)酵大豆，其葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)是原料大豆的3倍左右。Mo等[27]研究了不同工藝制作的豆酵餅和豆腐，并對其葉酸、維生素B12和大豆異黃酮的含量進(jìn)行測定，得出的結(jié)論是大豆經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后葉酸含量下降了。原因可能是樣品大豆中有充足的葉酸，而Lb.plantarum JH-M1-6-30和Lb.plantarum YML4-3在葉酸存在的情況下，自身不產(chǎn)生葉酸，而是先利用原材料中的葉酸，在沒有葉酸存在的情況下菌株自身才能利用其它底物合成葉酸以供自身生命活動所需。而Lb.plantarum SP8-7發(fā)酵大豆后，葉酸含量增加至原料大豆的3倍，可能是這株植物乳桿菌在葉酸存在的情況下也能自身合成葉酸，其合成葉酸不受原材料中葉酸存在與否的影響，具體原因還需對本株菌的葉酸代謝途徑做進(jìn)一步分析。綜上，Lb.plantarum SP8-7是發(fā)酵大豆高產(chǎn)葉酸的最佳菌株。

圖7 植物乳桿菌發(fā)酵前后大豆的葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig.7 Folate content in soybean before and after Lb.plantarum fermentation

3 結(jié)語

選用3株高產(chǎn)葉酸菌株，Lb.plantarum SP8-7，Lb.plantarum JH-M1-6-30和Lb.plantarum YML4-3來發(fā)酵純奶和大豆，Lb.plantarum JH-M1-6-30發(fā)酵純奶后，葉酸產(chǎn)量增加了20多倍，因此，實(shí)際生產(chǎn)可以選用Lb.plantarum JH-M1-6-30制作富含葉酸的酸奶。經(jīng)Lb.plantarum JH-M1-6-30發(fā)酵的大豆，口感和整體感官性能都很好，但發(fā)酵后葉酸產(chǎn)量下降了很多，因此不適合將其開發(fā)為葉酸補(bǔ)充食品。選用Lb.plantarum YML4-3發(fā)酵純奶和發(fā)酵大豆整體效果不錯，純奶經(jīng)發(fā)酵后葉酸的產(chǎn)量增加，但是大豆經(jīng)發(fā)酵后葉酸的產(chǎn)量仍然較低，因此也可將Lb.plantarum JH-M1-6-30與YML4-3聯(lián)合用于富含葉酸酸奶的制作。經(jīng)Lb.plantarum SP8-7發(fā)酵獲得的酸奶，不僅凝固性和口感都較差，而且葉酸產(chǎn)量也不高，但是由其發(fā)酵而得的發(fā)酵大豆，整體感官評價(jià)很好，葉酸產(chǎn)量也明顯增加，因此，可以選用Lb.plantarum SP8-7制作富含葉酸的發(fā)酵大豆。

雖然在所有的乳酸菌中，植物乳桿菌是葉酸產(chǎn)量最高的菌種，但總體而言，遠(yuǎn)沒有達(dá)到大規(guī)模生產(chǎn)的要求，仍要解決諸多的問題。由于菌體自身的生命活動也需要葉酸的參與，葉酸的產(chǎn)生和消耗并存，因此如何在保持菌體基本生命活動的同時(shí)，還能大量產(chǎn)生葉酸，是將來研究的重點(diǎn)。要解決這一難題，掌握發(fā)酵時(shí)間，選擇合適的發(fā)酵條件和發(fā)酵基質(zhì)相當(dāng)重要，也可以利用基因工程對菌株產(chǎn)葉酸的相關(guān)基因進(jìn)行改造。