王碧雯 ， 李顏顏 *，王小元

(1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122；2.食品安全國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫 214122）

脂多糖 （Lipopolysaccharides，LPS）， 俗稱內(nèi)毒素，是大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞外膜的主要組成部分[1-2]。LPS的結(jié)構(gòu)分為2部分：疏水的Kdo2-lipid A 和親水的多糖長(zhǎng)鏈（Polysaccharides，PS），其在維持細(xì)胞外膜滲透性和穩(wěn)定性上起到重要作用[3]。LPS能被哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的Toll樣受體4（TLR4）識(shí)別而激活先天性免疫系統(tǒng)、誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子的釋放。毒性高的LPS可引起促炎癥細(xì)胞因子過(guò)量釋放，引發(fā)熱休克甚至死亡，而低毒性的LPS或其衍生物能有效激活先天性免疫系統(tǒng)但不會(huì)產(chǎn)生過(guò)量炎癥分子，可作為免疫系統(tǒng)激活劑而被開(kāi)發(fā)成疫苗或疫苗佐劑[4-5]。由于LPS提取工藝復(fù)雜、提取中需要用到大量的有機(jī)溶劑，如苯酚等，同時(shí)LPS分子量大、多糖長(zhǎng)鏈部分結(jié)構(gòu)各異，難以直接檢測(cè)或定量，在生物免疫學(xué)研究及臨床試驗(yàn)中有較大局限性。因此，降低LPS毒性、優(yōu)化LPS結(jié)構(gòu)、簡(jiǎn)化LPS提取檢測(cè)步驟成為開(kāi)發(fā)利用細(xì)菌內(nèi)毒素的關(guān)鍵。

Kdo2-lipid A是LPS的生物活性中心和毒性中心，是細(xì)菌維持正常生長(zhǎng)的最小LPS結(jié)構(gòu)[5]。野生型大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）的 LPS 結(jié)構(gòu)如圖1所示，包含雙磷酸、6條脂肪酸鏈的Kdo2-lipid A和一條多糖長(zhǎng)鏈。Kdo2-lipid A與多糖長(zhǎng)鏈的連接是由LPS合成途徑中的waaC-waaF基因編碼的2個(gè)庚糖轉(zhuǎn)移酶WaaC和WaaF催化完成[6]，前人研究利用四環(huán)素抗性基因插入waaC-waaF基因簇而使之失活，得到只合成短鏈LPS，即Kdo2-lipid A的菌株WBB06。Kdo2-lipid A相對(duì)分子質(zhì)量小，具有雙親性，可通過(guò)三氯甲烷/甲醇體系簡(jiǎn)易萃取，并通過(guò)薄層層析的方法定量分析，在定性的質(zhì)譜檢測(cè)中更易電離、有高靈敏度，在水相體系中也有一定溶解度。因此，在疫苗或疫苗佐劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用中，Kdo2-lipid A較LPS更有優(yōu)勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了一株外源基因組成型表達(dá)菌HW003[7]，該菌在E.coli W3110的染色體上敲除lacI基因，并lacZ位點(diǎn)中插入Kdo2-lipid A外源修飾基因lpxE（來(lái)自弗朗西斯菌株，編碼的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移酶LpxE，能夠特異性地去除Kdo2-lipid A的C1位磷酸基團(tuán)[8]）和pagL（來(lái)自沙門氏菌，編碼的脫酰基酶PagL能夠特異性地去除Kdo2-lipid A的C3棕櫚酸脂肪酸鏈[9]），其合成的LPS包含特殊結(jié)構(gòu)Kdo2-lipid A及多糖長(zhǎng)鏈，較野生型W3110的LPS毒性降低。本研究在HW003菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)一步精簡(jiǎn)LPS結(jié)構(gòu)，敲除與糖鏈中庚糖合成相關(guān)waaC-waaF基因，構(gòu)建了一株無(wú)抗性標(biāo)記、能夠直接合成不含多糖長(zhǎng)鏈的、特殊結(jié)構(gòu)Kdo2-lipid A的突變株BW003。隨后研究了BW003菌株合成的Kdo2-lipid A的結(jié)構(gòu)、菌株及其Kdo2-lipid A的細(xì)胞毒性及菌株相關(guān)生化表型，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為疫苗佐劑及工業(yè)生產(chǎn)菌株奠定基礎(chǔ)。

圖1 E.coli LPS的結(jié)構(gòu)及相關(guān)合成、修飾酶Fig.1 Structure of E.coli LPS and relative synthetic or modify enzymes

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株、質(zhì)粒和引物 所涉及的實(shí)驗(yàn)大腸桿菌和輔助質(zhì)粒列于表1，所涉及的引物列于表2。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 培養(yǎng)E.coli時(shí)均用LB培養(yǎng)基（蛋白胨 10 g/L，酵母膏 5 g/L，氯化鈉 10 g/L，調(diào)pH到7.4）；含pKD46或pCP20質(zhì)粒的菌株在30℃下培養(yǎng)，篩選時(shí)需加入50 mg/L氨芐霉素；敲除片段同源重組轉(zhuǎn)化子篩選時(shí)需加入30 mg/L卡那霉素；其它菌株均在37℃培養(yǎng)。

1.1.3 工具酶和主要試劑 PCR試劑盒，購(gòu)買于廣州東盛生物科技有限公司；Ex Taq聚合酶，購(gòu)買于TaKaRa公司。

表1 本研究所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this research

表2 本研究用到的引物Table 2 Primers in this research

核酸染料：GoldView，購(gòu)買于上海賽百盛基因技術(shù)有限公司；核酸電泳 Marker，購(gòu)買于Fermentas公司。DNA水解酶 I、RNA水解酶A和蛋白水解酶K，購(gòu)買于上海生工生物工程有限公司。酵母膏干粉和蛋白胨，購(gòu)買于英國(guó)OXIOID公司；Ampicillin和Kanamycin抗生素、L-阿拉伯糖、瓊脂糖、瓊脂粉，均購(gòu)買于上海捷瑞生物有限公司；硅膠60薄層層析板，購(gòu)買于德國(guó)默克公司；分析純級(jí)別的氯化鈉、三氯甲烷、甲醇等常規(guī)試劑，購(gòu)買于國(guó)藥集團(tuán)。DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、2.5 g/L胰酶、青霉素-鏈霉素溶液，購(gòu)買于GIBCO公司；胎牛血清，購(gòu)買于 Thermo-Hyclone公司；PMA、DMSO， 購(gòu)買于Sigma-Aldrich公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板，購(gòu)買于 Corning公司；HEK-Blue hTLR4細(xì)胞、Normocin多效抗生素、HEK-Blue篩選液及HEK-Blue檢測(cè)液，購(gòu)買于Invivogen公司；THP-1細(xì)胞，購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；所有細(xì)胞因子ELISA試劑盒，購(gòu)買于R&D公司。

1.2 方法

1.2.1 BW003菌株的構(gòu)建 基于同源重組和位點(diǎn)特異性重組原理，waaC-waaF基因的敲除采用Datsenko[10]和Cherepanov等[11]報(bào)道的方法，敲除過(guò)程如圖2所示。首先，在E.coli JM109中構(gòu)建waaC-waaF基因的敲除質(zhì)粒pBS-CFkan，再由PCR從敲除質(zhì)粒上將敲除片段擴(kuò)增出來(lái)、純化、回收。在已構(gòu)建好lpxE-pagL組成型表達(dá)的菌株HW003（W3110△lacI lacZ：：lpxE-pagL）中轉(zhuǎn)入pKD46輔助質(zhì)粒。HW003/pKD46菌株在L-阿拉伯糖誘導(dǎo)培養(yǎng)、制備成感受態(tài)后將敲除片段轉(zhuǎn)入，使其發(fā)生同源重組從而敲除目的基因。篩選出正確轉(zhuǎn)化子后，通過(guò)高溫42℃培養(yǎng)去除pKD46質(zhì)粒，再在轉(zhuǎn)化子中轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒促使位于kan片段兩端的FRT位點(diǎn)發(fā)生位點(diǎn)特異性重組，從而去除kan片段。最后通過(guò)高溫42℃培養(yǎng)去除pCP20質(zhì)粒，進(jìn)而得到無(wú)抗突變株BW003。E.coli感受態(tài)細(xì)胞制備方法和轉(zhuǎn)化方法參照Han等[12]報(bào)道的方法。

1.2.2 Kdo2-lipid A與LPS的提取與純化制備Kdo2-lipid A粗樣采用Bligh-Dyer萃取法[13]。200 mL過(guò)夜培養(yǎng)菌液離心以收集菌體，所得菌體雙蒸水洗滌一次后用38 mL三氯甲烷/甲醇/水一相體系（1∶2∶0.8，體積比）重懸菌體，磁力攪拌破碎1 h，離心分相，棄下相固體碎片、取上清液再加入10 mL三氯甲烷和10 mL水，配成三氯甲烷/甲醇/水二相體系（2∶2∶1.8，體積比）；再次離心以分相，將下相液體移至旋蒸瓶，旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，所得粗樣-20℃保存。Kdo2-lipid A樣品的純化制備參照Z(yǔ)hou等[14]的DEAE-纖維素陰離子交換層析方法：將BW003的Kdo2-lipid A 粗樣溶于 5 mL 三氯甲烷/甲醇/水（2∶3∶1，體積比）溶液，上樣于一個(gè)事先用6倍體積三氯甲烷/甲醇/水 （2∶3∶1， 體積比） 溶液平衡的、10 mL DEAE-纖維素陰離子交換柱；用三氯甲烷/甲醇/240 mmol/L 醋酸銨（2∶3∶1，體積比）溶液洗脫磷脂等雜質(zhì)，再用三氯甲烷/甲醇/480 mmol/L 醋酸銨（2∶3∶1，體積比）溶液將Kdo2-lipid A進(jìn)行洗脫并收集；收集洗脫液配成三氯甲烷/甲醇/水二相體系 （2∶2∶1.8，體積比）；離心取下相，旋蒸除去溶劑，得Kdo2-lipid A純品，-20℃保存。

圖2 W3110，HW003，BW003菌株染色體基因型比對(duì)和waaC-waaF敲除示意圖Fig.2 Diagrams of chromosomes genotype alignment of strains W3110,HW003,BW003 and the deletion of waaC-waaF

LPS樣品的提取采用熱酚法[13]。離心菌液收集約5 g濕菌體，用雙蒸水洗滌菌體一次后加入18 mL水和22 mL體積分?jǐn)?shù)90%苯酚，68℃震蕩1 h；冷卻后4℃離心分相，取上相透析24 h以去除苯酚；透析后的溶液經(jīng)真空冷凍干燥得到LPS粗樣。LPS粗樣按照Karow等[15]方法，復(fù)溶后添加DNA水解酶I、RNA水解酶A和蛋白水解酶K處理去除核酸及蛋白質(zhì)，真空冷凍干燥后再用三氯甲烷-甲醇混合溶液洗滌以去除磷脂，最后復(fù)溶于雙蒸水中真空冷凍凍干，得LPS純品，4℃保存。

1.2.3 Kdo2-lipid A的薄層層析（TLC）分析及電噴霧電離質(zhì)譜（ESI/MS）分析 薄層層析（TLC）分析及電噴霧電離質(zhì)譜（ESI/MS）分析均按照Wang等[16]的方法，Kdo2-lipid A 粗樣溶于三氯甲烷/甲醇（2∶1，體積比），TLC分析時(shí)將樣品點(diǎn)于硅膠60 TLC板上，在三氯甲烷/甲醇/冰醋酸/水（25∶15∶2∶1，體積比）的展層劑中層析，層析結(jié)束后吹干板上殘留展層劑，用乙醇/硫酸（1∶9，體積比）溶液進(jìn)行碳化，最后加熱至180℃顯色；ESI/MS分析時(shí)，進(jìn)樣于WATERS SYNAPT Q-TOF Mass Spectrometer質(zhì)譜儀，在120 V錐孔電壓、負(fù)離子掃描模式下檢測(cè)m/z 1 000～2 500范圍的離子，所得數(shù)據(jù)用MassLynx V4.1 software軟件處理分析。

1.2.4 HEK-Blue hTLR4細(xì)胞毒性分析 HEKBlue hTLR4細(xì)胞是經(jīng)轉(zhuǎn)染改造的人腎上皮細(xì)胞，是在HEK293細(xì)胞中表達(dá)了人TLR4及NF-kB誘導(dǎo)分泌的胚胎堿性磷酸激酶報(bào)告基因，能特異性識(shí)別LPS或含有LPS的細(xì)菌、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LPS誘導(dǎo)的TLR4免疫通路的強(qiáng)弱，通過(guò)顯色反應(yīng)檢測(cè)出對(duì)應(yīng)樣品的TLR4的刺激能力和對(duì)細(xì)胞的毒性。HEKBlue hTLR4細(xì)胞培養(yǎng)參照Needham等[17]的方法和細(xì)胞使用說(shuō)明書。細(xì)菌菌體收集后用無(wú)熱源磷酸緩沖液（PBS）洗2次后梯度稀釋，先加入96孔板，無(wú)菌PBS作為空白對(duì)照；HEK-Blue hTLR4細(xì)胞收集計(jì)數(shù)后用HEK-BlueTM檢測(cè)液重懸再接種至96孔板；細(xì)菌和細(xì)胞混合培養(yǎng)12 h后檢測(cè)OD650的吸光度，吸光度與TLR4信號(hào)通路激起的強(qiáng)度成正比。

1.2.5 THP-1細(xì)胞的毒性分析 細(xì)胞培養(yǎng)參照Li等[18]的方法。細(xì)胞收獲計(jì)數(shù)后，按終質(zhì)量濃度20 ng/mL添加PMA并將細(xì)胞懸液接種至96孔板，培養(yǎng)12 h后細(xì)胞分化貼壁，倒棄舊培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基，同時(shí)加入質(zhì)量濃度分別為 100、10、1、0.1 ng/mL的Kdo2-lipid A或LPS純化樣品，以不添加樣品的新鮮培養(yǎng)基作空白對(duì)照。細(xì)胞再培養(yǎng)24 h后離心取培養(yǎng)上清液，保存于 -80℃。用于ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子 TNF-α、IL-8和RANTES的刺激釋放量。

1.2.6 菌株生化表型分析

1）菌株細(xì)胞表面疏水性的測(cè)定。參照Del Re等[19]的方法，用PBS洗滌菌體一次并重懸，控制菌懸液OD600=0.5；取3 mL菌懸液置于試管中，再加入1 mL二甲苯，劇烈震蕩2 min后靜置0.5 h，取下相液體測(cè)OD600。

2）菌株外膜滲透性的測(cè)定。菌株外膜滲透性測(cè)定采用 NPN（N-Phenyl naphthylamine）方法[20]。離心收集菌體，用PBS洗滌菌體一次并重懸，控制菌懸液OD600=0.5；取1.92 mL菌懸液與80 μL 1 mmol/L的NPN溶液混勻于石英比色皿中，測(cè)定激發(fā)波長(zhǎng)350 nm、發(fā)射波長(zhǎng)420 nm、縫寬5 mm條件下的熒光吸收值。外膜滲透性與熒光吸收強(qiáng)度成正比。

3）菌株自凝集能力的測(cè)定。參照Rahman等[21]的方法，離心過(guò)夜培養(yǎng)菌液以收集菌體，用PBS洗滌菌體一次并重懸，控制菌懸液OD600≈2.0（記為A0，保留三位有效數(shù)字）。取10 mL菌液轉(zhuǎn)移至刻度管，22℃靜置 24 h，測(cè)定菌液 OD600值（記為 Ai，保留三位有效數(shù)字）。

自凝集百分?jǐn)?shù) AAg%=[（A0-Ai）/A0]×100

4）菌株抗生素MIC值的測(cè)定。將新生霉素（Novobiocin）用LB液體培養(yǎng)基倍比稀釋，使質(zhì)量濃度 分 別 為 1 000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.80、3.90 μg/mL，加入96孔板中，留一排新型LB培養(yǎng)基作生長(zhǎng)對(duì)照；另將等體積OD600=0.01的稀釋菌液加入96孔板中，蓋上蓋子，37℃靜置培養(yǎng)12 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定菌液OD600。將OD600小于0.15的點(diǎn)對(duì)應(yīng)的抗生素濃度定義為菌株對(duì)新生霉素的MIC值。

2 結(jié)果與討論

2.1 BW003菌株的構(gòu)建

首先，對(duì)出發(fā)菌株HW003進(jìn)行PCR鑒定（圖3（a））。以lacZ-F/R（lacZ位點(diǎn)中間位置設(shè)計(jì)的一對(duì)引物）為引物，W3110基因組lacZ位點(diǎn)PCR產(chǎn)物大小為 300 bp 左右（圖3（a）的 1 泳道）；HW003 基因組PCR 產(chǎn)物則為 1 996 bp（圖3（a）的 2 泳道），電泳結(jié)果驗(yàn)證表明出發(fā)菌株HW003的lacZ位點(diǎn)中成功插入lpxE-pagL基因。隨后，通過(guò)同源重組的方法開(kāi)始敲除waaC-waaF基因，成功敲除后，PCR驗(yàn)證圖如圖3（b）所示。 圖3（b）1 泳道是以 waaC-waaF-F/R為引物，對(duì)HW003菌株基因組PCR得到的產(chǎn)物，大小為2 495 bp，是waaC-waaF基因未敲除的大小。泳道圖3（b）2泳道是敲除片段同源重組后轉(zhuǎn)化子基因組PCR所得產(chǎn)物，大小為1 668 bp。圖3（b）3泳道則是去除kan片段后，BW003菌株基因組PCR產(chǎn)物，大小為635 bp，表明waaC-waaF基因敲除成功。

圖3 各菌株lacZ位點(diǎn)和waaC-waaF基因段染色體PCR驗(yàn)證電泳圖Fig.3 Verification of lazZ site and waaC-waaF gene by PCR

2.2 BW003菌株合成的Kdo2-lipid A結(jié)構(gòu)鑒定

用已知 Kdo2-lipid A生產(chǎn)菌 WBB06（W3110 waaC-waaF：：tet6）作為對(duì)照[6，22]，根據(jù) Bligh-Dyer 萃取法分別提取WBB06和BW003菌株合成的Kdo2-lipid A，樣品分別點(diǎn)在硅膠60 TLC板上，層析顯色，得圖4（a）。根據(jù)展層劑性質(zhì)，樣品遷移速度與疏水性成正比，即磷酸基團(tuán)越少、脂肪酸鏈越多遷移速度越快。磷脂相對(duì)分子質(zhì)量小、疏水性最強(qiáng)，遷移速度最快，顯色于TLC板上方。Kdo2-lipid A則集中于TLC板中部。WBB06粗樣只含有單一的、雙磷酸、6條脂肪酸鏈的Kdo2-lipid A，在TLC板上只有1個(gè)顯色點(diǎn)；而B(niǎo)W003的粗樣則呈現(xiàn)出上中下3個(gè)顯色點(diǎn)，可見(jiàn)BW003合成了3種不同結(jié)構(gòu)的Kdo2-lipid A。根據(jù)親疏水性，推測(cè)中間一點(diǎn)為L(zhǎng)pxE與PagL共同作用修飾后生成的目標(biāo)產(chǎn)物-單磷酸、5條脂肪酸鏈的Kdo2-penteacyl-monophosphate-lipid A（Kdo2-P-MPLA）；而目標(biāo)產(chǎn)物下方的點(diǎn)與WBB06顯色點(diǎn)平齊，則推測(cè)同為野生型雙磷酸、6條脂肪酸鏈的Kdo2-lipid A；上方點(diǎn)則推測(cè)為L(zhǎng)pxE作用，但PagL未作用而生成的單磷酸、6條脂肪酸鏈的Kdo2-monophosphate-lipid A（Kdo2-MPLA）。

通過(guò)電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）對(duì)菌株BW003的粗樣進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。質(zhì)譜結(jié)果與TLC分析相符合，BW003菌株粗樣在質(zhì)譜中檢測(cè)出3個(gè)主要的[M-H]-負(fù)離子峰，分別是 m/z 1 930、2 156和 2 236，與平均相對(duì)分子質(zhì)量為 1 931、2 157和2 237的Kdo2-P-MPLA、Kdo2-MPLA和 Kdo2-lipid A相對(duì)應(yīng)。結(jié)果表明BW003菌株能夠直接合成不含多糖長(zhǎng)鏈的、特殊結(jié)構(gòu)的Kdo2-P-MPLA，但同時(shí)混有部分Kdo2-lipid A和Kdo2-MPLA。

2.3 活菌刺激HEK-Blue hTLR4細(xì)胞的毒性分析

活菌直接刺激HEK-Blue hTLR4細(xì)胞后細(xì)胞液Abs650的吸光度正比于TLR4信號(hào)通路激起的強(qiáng)度。如圖5所示，W3110，HW003及BW003活菌體都能有效激起TLR4信號(hào)通路；在菌濃度為103～106CFU/mL范圍內(nèi)，三者激起的TLR4信號(hào)強(qiáng)弱有明顯差別：W3110最高，HW003適中，BW003最低；尤其在104 CFU/mL時(shí)，W3110的OD650高達(dá)1.02，HW003的OD650降低為0.66，而直接合成特殊結(jié)構(gòu)Kdo2-lipid A的BW003菌株的OD650只有0.48，較W3110降低53%。研究結(jié)果表明BW003菌株LPS結(jié)構(gòu)改變后，刺激細(xì)胞的毒性比野生型W3110菌株明顯下降。

圖4 BW003合成的Kdo2-lipid A薄層層析分析與電噴霧電離質(zhì)譜分析Fig.4 TLC analysis and ESI/MS analysis of Kdo2-lipid A from BW003

圖5 E.coli W3110，HW003及BW003活菌體對(duì)TLR4信號(hào)通路激起的強(qiáng)度比較Fig.5 Comparison of TLR4 stimulation of whole bacterial cells of E.coli W3110，HW003 and BW003

2.4 Kdo2-lipid A刺激THP-1細(xì)胞的毒性分析

為進(jìn)一步研究LPS分子結(jié)構(gòu)的改變對(duì)免疫細(xì)胞的毒性的影響，純化后的W3110 LPS、HW003 LPS及BW003 Kdo2-lipid A樣品被梯度稀釋用于刺激人的THP-1巨噬細(xì)胞，并刺激后測(cè)定TLR4下游MyD88通路及TRIF通路的促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8和RANTES的釋放量，細(xì)胞因子釋放量越大說(shuō)明細(xì)胞毒性越高。如圖6所示，細(xì)胞因子釋放量與樣品質(zhì)量濃度成正比，W3110 LPS誘導(dǎo)TNF-α、IL-8及RANTES的分泌量在4個(gè)濃度下最高，其毒性最強(qiáng)。而HW003 LPS與BW003 Kdo2-lipid A二者免疫活性接近，細(xì)胞毒性均較W3110有明顯減弱。在樣品質(zhì)量濃度為100 ng/mL時(shí)，W3110 LPS誘導(dǎo) TNF-α、IL-8及 RANTES的分泌量分別為 2 202，19 347，7 261 pg/mL； 而 BW003 則 只 有 1 563，14 175，5 621 pg/mL， 分別降低了 29%、27%和22%，說(shuō)明BW003合成的特殊結(jié)構(gòu)Kdo2-P-MPLA，雖然混合了其他2個(gè)結(jié)構(gòu)，但較野生型的LPS能夠明顯減毒，同時(shí)也保持了一定的免疫活性，具有開(kāi)發(fā)為新型疫苗佐劑的潛力。

2.5 菌株生化表型分析

以W3110和HW003作為對(duì)照，對(duì)BW003菌株的表型進(jìn)行分析測(cè)定。由圖7（a）可見(jiàn)，表達(dá)lpxE-pagL基因后HW003的疏水性較W3110（40%）略有提升，而表達(dá)lpxE-pagL基因并敲除waaC-waaF的BW003菌株由于其LPS同時(shí)缺失C1位磷酸基團(tuán)、C3位脂肪酸鏈和多糖長(zhǎng)鏈，菌株的外膜滲透性則明顯升至W3110菌株的3倍，而對(duì)照的HW003菌株的外膜滲透性是W3110菌株的1.23倍。更高的外膜滲透性也使得抗生素更容易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生作用，因此BW003也表現(xiàn)出對(duì)抗生素的高度敏感，由圖7（b）可見(jiàn)，W3110對(duì)新生霉素的MIC為1 000 μg/mL，HW003 略低，為 500 μg/mL，而B(niǎo)W003對(duì)新生霉素的MIC則驟降為15.6 μg/mL。另一方面，LPS結(jié)構(gòu)的改變使得BW003菌株的細(xì)胞表面疏水性提升至83%（圖7（c））。疏水性的增加使得菌株在液體培養(yǎng)體系中更容易聚團(tuán)、凝集，在靜置24小時(shí)后，BW003的自凝集比例為93%，而W3110和HW003僅為 23%和 22%（圖7（d））。

圖7 W3110、HW003及BW003菌株、外膜滲透性、新生霉素MIC、疏水性、自凝集能力的比較Fig.7 Comparison of membrane permeability，Novobiocin MIC，hydrophobicity and auto-aggregation of E.coli strains W3110，HW003 and BW003

3 結(jié)語(yǔ)

LPS能被哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的TLR4受體識(shí)別激活先天性免疫反應(yīng)，具有被進(jìn)一步發(fā)展成為新型疫苗或疫苗佐劑的潛力。但LPS前期提取工藝復(fù)雜，消耗大量的苯酚，純化步驟也相對(duì)繁瑣，且由于LPS相對(duì)分子質(zhì)量大、多糖長(zhǎng)鏈部分結(jié)構(gòu)各異，難以直接檢測(cè)或定量，在生物免疫學(xué)研究及臨床試驗(yàn)中有較大局限性。

本研究通過(guò)敲除HW003菌株中與多糖長(zhǎng)鏈合成相關(guān)的waaC-waaF基因，使得多糖長(zhǎng)鏈無(wú)法與Kdo2-lipid A相連接，成功構(gòu)建一株直接合成新型、特殊結(jié)構(gòu)的Kdo2-lipid A的突變株BW003。該菌株合成的LPS結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其合成的新型Kdo2-lipid A可由三氯甲烷/甲醇/水體系簡(jiǎn)易快速萃取得到，不用消耗苯酚；其純化步驟也較為便捷可行，通過(guò)DEAE離子交換柱梯度洗脫便可實(shí)現(xiàn)。Kdo2-lipid A可用TLC和ESI/MS直接分析、便于進(jìn)行實(shí)時(shí)定量與檢測(cè)，能夠更好的應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室或臨床研究中。

BW003菌株合成的LPS結(jié)構(gòu)定向改變后，菌株的外膜滲透性、抗生素敏感性、細(xì)胞表面疏水性及菌體自凝集能力較野生型W3110與HW003，均有一定程度的提高。外膜滲透性的改變加速了細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換，菌體自凝集能力的增強(qiáng)簡(jiǎn)化了菌體收集的步驟，為后續(xù)在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)菌株的制備奠定了良好基礎(chǔ)。

BW003菌株合成的Kdo2-lipid A具有多樣性，共包括3種結(jié)構(gòu)：Kdo2-P-MPLA （單磷酸、5條脂肪酸鏈）、Kdo2-MPLA（單磷酸、6條脂肪酸鏈）和Kdo2-lipid A（雙磷酸、6條脂肪酸鏈）；其合成產(chǎn)物的多樣性是由LpxE和PagL 2個(gè)結(jié)構(gòu)修飾酶作用效果不完全所致。新型特殊結(jié)構(gòu)Kdo2-lipid A的存在，使得BW003菌體的毒性顯著下降。HEK-Blue hTLR4細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BW003較野生型W3110的TLR4信號(hào)強(qiáng)度降低53%。純化后BW003合成的Kdo2-lipid A分子刺激THP-1細(xì)胞后產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-8和RANTES的濃度明顯降低，表明Kdo2-lipid A分子較W3110的LPS而言，內(nèi)毒素毒性減弱。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究不同結(jié)構(gòu)內(nèi)毒素的生物免疫活性、開(kāi)發(fā)相關(guān)的新型疫苗及其疫苗佐劑奠定了基礎(chǔ)。