蔚曉敏 ，武曉麗 ，楊 棟 ，裘 梁 ，，吳姚平，王登遠(yuǎn)，魏 華，徐 鋒*

（1.南昌大學(xué) 中德聯(lián)合研究院，江西 南昌330047；2.江西中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，江西 南昌330004）

近3年，SCIENCE和NATURE等高水平雜志發(fā)表了一系列文章，科學(xué)家們提出，腸道菌群可作為一個(gè)虛擬器官[1]，影響著人體的發(fā)育生長、營養(yǎng)與健康，甚至其與代謝性疾病（腸易激綜合癥[2]、炎癥性腸病[3]、心血管疾病[4-5]、糖尿病[6]、肥胖[7]等）密切相關(guān)，闡述并證明了腸道菌群與人體健康乃至長壽的關(guān)聯(lián)性。

湖南省瀏陽市高田村地理位置相對(duì)封閉，其村民不僅長壽，而且普遍沒有慢性疾病。與此形成鮮明對(duì)比的是，周邊地區(qū)既無長壽現(xiàn)象，而且心血管疾病、慢性腸胃炎和癌癥等疾病時(shí)有發(fā)生。但是有關(guān)該地區(qū)老人長壽原因，還未見任何報(bào)道，缺乏系統(tǒng)的研究。因?yàn)樵摯宓木用衽c周邊地區(qū)一直保持著婚配，故推測(cè)這里的長壽現(xiàn)象可能與遺傳因素聯(lián)系不緊密。Gierman等[8]通過完成了17例高加索地區(qū)百歲老人的全基因組測(cè)序，證明基因影響較小，而環(huán)境因素可能對(duì)長壽影響較大。腸道菌群受飲食、作息習(xí)慣，以及氣候等[9-11]外界因素影響，導(dǎo)致不同人群之間差異很大，進(jìn)而影響了人體的健康與長壽。

乳酸菌可調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫力，降低血清膽固醇，降血壓，抗氧化抑制腫瘤發(fā)生等方面的特殊生理活性。長雙歧桿菌BBMN68[12]分離自廣西巴馬長壽老人糞便，其活菌液對(duì)便秘模型小鼠有潤腸通便作用，提高免疫力。唾液乳桿菌FDB86[13]可以緩解二甲肼對(duì)腸道菌群的不良影響，使腸道菌群趨近于正常狀態(tài)，對(duì)結(jié)腸癌大鼠腸道菌群變化的調(diào)節(jié)作用。另外生物氧化是機(jī)體新陳代謝的重要生理過程，但此過程中會(huì)產(chǎn)生多種自由基，自由基的累積，會(huì)造成體內(nèi)氧化損傷逐漸增多，導(dǎo)致老年慢性病發(fā)生，而清除過多的自由基可以延緩衰老[14]。

故此本文作者希望通過解析并分離高田村老人腸道菌群的特有菌株，從中篩選出抗氧化能力強(qiáng)的菌株，以期為今后探究長壽機(jī)制，預(yù)防老年慢性病，開發(fā)新型微生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

MRS培養(yǎng)基，DPPH，鄰二氮菲，硫酸亞鐵，PBS緩沖液，蛋白胨，牛膽鹽,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；30%H2O2，西隴科學(xué)產(chǎn)品；無水乙醇，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;胃蛋白酶，胰蛋白酶，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器

顯微鏡，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，美國Queue公司產(chǎn)品；離心機(jī)，長沙維爾康湘鷹公司產(chǎn)品；厭氧培養(yǎng)箱，PLAS-LABS公司產(chǎn)品；全自動(dòng)高壓滅菌鍋，中國上海博訊公司產(chǎn)品；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化有限公司產(chǎn)品；紫外可見光分光光度計(jì)，Genesys 10s公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糞便樣品來源及采集，保藏 取采樣前3個(gè)月未服用藥物的21名高田村健康長壽老人的糞便。將晨起第一次新鮮的糞便5～10 g于無菌的離心管中，并立刻置于干冰中，一部分用于提取細(xì)菌DNA后，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行16S rDNA高通量測(cè)序，另一部分進(jìn)行菌株分離篩選。

對(duì)該地區(qū)居民糞便進(jìn)行分組，其中LLG1是該地區(qū)90歲以上的老人，平均年齡為93歲，樣本量N=3；LLG2為80～89歲老人，平均年齡為84.4歲，樣本量N=5；LLG3組為一長壽家族中的父母及其兒女組成，其中年齡最大的為父親91歲，最小的兒子50歲，平均年齡69歲；LLG4年齡范圍是70～79，平均年齡為 72歲，N=4；LLG5年齡區(qū)間為 60～69歲，平均年齡63.5歲，N=4。每組樣本為相應(yīng)該組成員糞便樣等量混合均勻后提取DNA進(jìn)行測(cè)序比較分析。

1.3.2 菌株分離方法 根據(jù)測(cè)序的結(jié)果，選擇乳酸菌作為分離的目標(biāo)菌。分別取1 g糞便溶于10 mL 10%蛋白胨溶液中，充分溶解，濾紙濾去殘?jiān)?，濾液

用5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，收集沉淀，用1 mL 10%蛋白胨水重懸。按1%接種體積分?jǐn)?shù)到MRS液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)液采用10倍梯度稀釋， 梯度稀釋為 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8和 10-9，每個(gè)梯度取 1 mL 分別均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基，37℃，厭氧培養(yǎng)48 h。從每份糞便樣品中，挑取10株菌落形態(tài)不同的菌株，進(jìn)行純培養(yǎng)。將培養(yǎng)過夜的新鮮菌液用15%的脫脂乳保菌，于-70℃冰箱保藏菌株。

1.3.3 菌株氧脅迫篩選 將新鮮培養(yǎng)的菌株以1%的體積比接種到含0.4 mmol/L H2O2的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)8 h，分別測(cè)定0 h與8 h的OD630，檢測(cè)菌株對(duì)H2O2的耐受性。選擇在此條件下生長狀況良好的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。用OD值差來表示菌株對(duì)H2O2的耐受性，即 ΔOD=OD6308h-OD6300h[15]。

1.3.4 菌株的鑒定 綜合評(píng)價(jià)性能良好的菌株進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)，以27F/1492R為引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，鑒定菌株的種屬。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。以待測(cè)菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系配置：Taq mix 10 μL，引物 1 μL，ddH2O 9 μL，總體積20 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性，95℃ 5 min，95℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)， 終延伸 72 ℃，10 min。用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)擴(kuò)增的目的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，得到的數(shù)據(jù)在NCBI數(shù)據(jù)庫中已知菌株的16S序列BLAST比較相似性，初步判斷菌株的種屬。

1.3.5 菌株對(duì)模擬胃液的耐受性評(píng)價(jià) 模擬胃液：將磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 2.2）中添加胃蛋白酶使終質(zhì)量濃度為3 mg/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。將對(duì)H2O2耐受性高的菌株的新鮮培養(yǎng)菌液，5 000 r/min離心10 min，菌體洗滌2次后重懸于模擬胃液中，保持菌濃度相同，37℃厭氧孵育30 min。在0 min和30 min分別用MRS固體培養(yǎng)基活菌計(jì)數(shù)[16]。

1.3.6 菌株對(duì)模擬腸液的耐受性的評(píng)價(jià) 模擬腸液：將PBS緩沖液pH調(diào)節(jié)為8.0，并添加體積分?jǐn)?shù)0.45%膽鹽，終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的胰蛋白酶，現(xiàn)用現(xiàn)配。將對(duì)H2O2耐受性高的菌株的新鮮培養(yǎng)液，5 000 rmp離心10 min，菌體洗滌兩次后重懸于模擬腸液中，保持菌濃度相同，37℃共孵育2 h。0 h和2 h分別用MRS固體培養(yǎng)基活菌計(jì)數(shù)[17]。

1.3.7 清除自由基能力的評(píng)價(jià) 按照接種量為1%接入MRS培養(yǎng)基中，厭氧37℃培養(yǎng)18 h，6 000 r/min離心10 min，分別收集發(fā)酵上清液和菌體。菌體用PBS（pH 7.2）溶液洗滌2次，再用PBS溶液重懸至乳酸菌數(shù)為109cfu/mL。發(fā)酵上清和重懸的菌體作為清除自由基試驗(yàn)的樣品。

DPPH自由基的清除試驗(yàn)，參考的方法[18]：2 mL樣品中加入2 mL DPPH無水乙醇溶液（0.2 mmol/L）混合均勻，室溫避光反應(yīng)30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液于517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)i；空白組以等體積無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液Ao，對(duì)照組以等體積空白溶劑代替樣品溶液Aj，并以等體積蒸餾水和乙醇混合液空白調(diào)零。

羥自由基清除試驗(yàn)，參照的方法[19]：0.5 mL的鄰二氮菲（6 mmol/L），0.5 mL 的 FeSO4溶液（6 mmol/L）與1.0 mL的PBS溶液（pH7.2）混勻。再向此體系中加入0.5 mL樣品和0.5 mL 0.1%過氧化氫，用雙蒸水將總體積定容至4.0 mL?；靹蚝笤?7℃下孵育1 h，于536 nm下讀取吸光度。羥自由基的清除率按下式（2）計(jì)算：

式 （2）中，As為樣品的吸光度值；Ao為H2O替代樣品；A為H2O替代H2O2和樣品

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測(cè)序結(jié)果

采用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)，對(duì)糞便微生物群落的16S rRNA的V4高變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)物種注釋，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品在各分類水平（Kingdom，Phylum，Class，Order，F(xiàn)amily，Genus，Species） （ 界 、門、綱、目、科、屬和種）上的序列數(shù)目，物種序列構(gòu)成柱狀圖見圖1。LLG4在各個(gè)水平上均高于其他組。從圖1可以看出，不同年齡段的物種的序列數(shù)不同，在種的水平上，LLG1高于其他組。在OTUs構(gòu)建過程中，對(duì)不同樣品的Effective Tags數(shù)據(jù)，低頻數(shù)的Tags數(shù)據(jù)和Tags注釋數(shù)據(jù)等信息進(jìn)行初步統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖2，樣品tag平均有25 759，平均OTU為955.6。不同樣品之間OTU對(duì)比的維恩圖，如圖3 所示，LLG1，LLG2，LLG3，LLG4，LLG5 共有345個(gè)OTU，其中一部分為乳酸菌。鑒于乳酸菌是比較認(rèn)可的安全菌株，故使用MRS選擇性培養(yǎng)基從該地區(qū)健康長壽老人糞便中篩選特有的乳酸菌，為開發(fā)新型微生物制劑奠定工作基礎(chǔ)。

圖1 每個(gè)樣品在各分類水平上的序列構(gòu)成柱形圖Fig.1 Each sample in the sequence of each classification level a bar chart

圖2 不同樣品的Tags和OTUs數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics number of Tags and OTUs of samples

圖3 各組樣品之間比較的維恩圖Fig.3 VEEN graph of compared with different samples

2.2 菌株對(duì)H2O2耐受性

各菌株對(duì)H2O2的耐受性表示不同，表1中菌株對(duì)0.4 mmol/L H2O2有較好的耐受性，受試菌株中L0105，L0302，L0608，L0902，L1001，L1014，LP1，LP2，LP3，LP4，LP5，LP6 對(duì) 0.4 mmol/L 有較高的耐受性，ΔOD＞0.9。其他的菌株基本不能生長，故不列于表中。

表1 分離菌株對(duì)H2O2的耐受性Table 1 Test of H2O2resistant

2.3 菌株的鑒定

為確定耐H2O2菌株的種屬，進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，提取各菌株的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 kb的DNA片段測(cè)序后，將測(cè)定序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果確定菌株種屬，具體結(jié)果見表2。其中，有5株發(fā)酵乳桿菌，2株植物乳桿菌，2株唾液乳桿菌，2株腸球菌，1株粘膜乳桿菌。

表2 菌株比對(duì)結(jié)果Table 2 Results of strains blast

2.4 對(duì)模擬胃液的耐受性

菌株在模擬胃液中孵育30 min后，菌株對(duì)胃液的耐受能力各不相同，如圖4所示。其中0105、0302、1014和P3的菌液濃度可以保持在108cfu/mL，降低一個(gè)數(shù)量級(jí)，而0608、P2和P6在模擬胃液中孵育后，菌液濃度降低最多，存活率約為1%。說明胃蛋白酶和低pH對(duì)菌株有較大的影響。益生菌在使用過程中，先暴露在胃環(huán)境中，而胃蛋白酶和低pH對(duì)菌株有較大影響，可對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，如微囊化、與牛乳等共同服用，緩解胃液對(duì)菌株的損傷，擴(kuò)大菌株的使用范圍。

圖4 耐H2O2菌株對(duì)模擬胃液的耐受性Fig.4 H2O2-resistant strains of resistance to simulated gastric juice

2.5 菌株對(duì)模擬腸液的耐受性

除P1，P2和P3，在模擬腸液中降低一個(gè)數(shù)量級(jí)外，其他菌株對(duì)模擬腸液均表現(xiàn)出較好的耐受性，2 h后，活菌濃度仍大于108cfu/mL，其中1014的耐受性最高，如圖5所示。與模擬胃液相比，模擬腸液對(duì)部分菌株的存活影響較小，說明胰蛋白酶和膽鹽對(duì)分離到菌株的存活影響較小，菌株能夠在模擬腸液中存活?？赡苁蔷攴蛛x自腸道，對(duì)腸液的適應(yīng)能力較強(qiáng)，而菌株沒有經(jīng)過胃液的作用，模擬胃液對(duì)其存活率影響較大?？梢娋甑膩碓粗苯佑绊懼陮?duì)模擬胃液，模擬腸液的耐受性。

圖5 耐H2O2菌株對(duì)模擬腸液的耐受性Fig.5 H2O2-resistant strains of simulated intestinal resistance

2.6 清除自由基

1014對(duì)模擬胃液和模擬腸液的均表現(xiàn)出較好的耐受性，因此進(jìn)一步評(píng)價(jià)其清除自由基的能力。由圖6可知，發(fā)酵乳桿菌1014的發(fā)酵上清液對(duì)DPPH、OH-自由基的清除率分別為 63.28%、71.59%，均高于菌株的清除率。Li[19]報(bào)道，植物乳桿菌C88對(duì)DPPH的清除率為53.05%，Das[15]報(bào)道，植物乳桿菌DM5清除羥基自由基為48%，發(fā)酵乳桿菌1014對(duì)自由基的清除能力較好。DPPH是很穩(wěn)定的自由基，菌體有較高的清除率表明受試菌株具有降低過氧化氫、過氧化自由基或脂質(zhì)自由基連鎖反應(yīng)的能力，而羥自由基是活潑型最強(qiáng)，氧化能力最大的自由基，是引起機(jī)體氧化作用的重要因素，清除羥自由基可有助于維持細(xì)胞膜的完整性，延緩細(xì)胞衰老。

圖6 發(fā)酵乳桿菌1014清除自由基的能力Fig.6 Ability scavenging of free radical on L.fermentum 1014

3 結(jié) 語

本研究以16S rDNA高通量測(cè)序?yàn)橐罁?jù)，分離篩選高田村居民腸道中共有的具有益生功能的乳酸桿菌。共分離到12株對(duì)H2O2耐受性較高的菌株，分別為5株發(fā)酵乳桿菌，2株植物乳桿菌，2株唾液乳桿菌，2株腸球菌，1株粘膜乳桿菌。對(duì)12株菌進(jìn)行模擬胃液和腸液的耐受性進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌1014具有較高的耐受性。進(jìn)一步評(píng)價(jià)1014的不同組分對(duì)自由基的清除能力，結(jié)果表明1014的發(fā)酵上清液發(fā)揮了主要清除自由基的能力，對(duì)DPPH，OH-自由基的清除率分別為 63.28%，71.59%，而菌體的清除自由基能力相對(duì)較弱。因此后期將在本研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步針對(duì)發(fā)酵乳桿菌1014體內(nèi)抗氧化研究同時(shí)研究其抗氧化物質(zhì)及抗氧化的分子調(diào)控機(jī)制。