彭霈，曹秉振

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，濟(jì)南250031)

熱射病是一種致死性急癥，臨床上以較高的核心溫度、皮膚干燥伴嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害(如譫妄、抽搐、昏迷)為主要臨床表現(xiàn)[1]。盡管熱射病發(fā)生時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷由病理及影像學(xué)變化可直接觀測到[2];但在全身炎性反應(yīng)綜合征發(fā)生時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎性因子發(fā)生變化的機(jī)制仍未明了。已有多個(gè)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，熱射病發(fā)生時(shí)巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平發(fā)生了變化[3，4]，巨噬細(xì)胞的極化方向與炎性因子密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞的極化[5]分為M1型和M2型，M1型為促炎性因子型，常見的M1型表面標(biāo)志物有HLA-DR、CD197、誘導(dǎo)型一氧化碳合酶(iNOS)等[6]；M2型為抗炎性因子型，M2型表面標(biāo)志物有CD206、CD301、Ⅰ型精氨酸酶(ArgⅠ)等[7]。2016年3～6月，本實(shí)驗(yàn)選取iNOS、ArgⅠ分別作為兩種極化方向的指標(biāo)檢測，探討熱射病模型大鼠巨噬細(xì)胞的極化方向。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 清潔級Wistar大鼠40只(36只+儲備4只)，體質(zhì)量200～250 g，8周左右，購自山東大學(xué)齊魯醫(yī)學(xué)院動物中心。適應(yīng)性生長2周后開始用于實(shí)驗(yàn)?？煽厥胶銣叵滟徸陨綎|瑞科電器公司；Aanti-CD68 antibody購自美國abcam公司；BX41顯微鏡、倒置相差顯微鏡購自日本奧林巴斯光學(xué)工業(yè)株式；RPMI-1640不完全培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；細(xì)胞核、漿蛋白抽取試劑盒，BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自上?？党缮锕?；iNOS(稀釋比1∶2 000)、ArgⅠ(稀釋比1∶2 000)購自美國abcam公司；Horseradish Peroxidase(HRP)結(jié)合的二級抗體、HRP-結(jié)合的抗生物素抗體購自上?？党缮?；Western顯影液、定影液購自上海冠龍照相器材公司；Western掃描儀購自上海天能科技有限公司。

1.2 動物分組及處理 將實(shí)驗(yàn)動物共分為熱暴露即刻組，熱暴露后1 d、2 d、3 d、7 d組，對照組共6組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組動物給予熱暴露溫度40 ℃，相對濕度60%，照射100 min建立熱射病大鼠模型。對照組不給予任何處理。

1.3 脾臟巨噬細(xì)胞的提取及鑒定 通過對南方醫(yī)科大學(xué)的熱射病復(fù)合內(nèi)毒素感染模型[8]的改裝，并借鑒臺灣學(xué)者的模型[9]，構(gòu)建熱射病大鼠模型。通過借鑒法舒地爾治療自身免疫性腦脊髓炎[10]一文中小鼠脾臟巨噬細(xì)胞的分離方法，并結(jié)合國內(nèi)對人、大鼠脾臟巨噬細(xì)胞分離技術(shù)[11]的研究進(jìn)展，取得大鼠脾臟巨噬細(xì)胞。具體步驟如下：大鼠熱射病造模結(jié)束后，水合氯醛4 mL/kg注射麻醉，然后無菌取出脾臟組織，通過清洗組織、制備細(xì)胞混懸液后，向沉淀中加入適量RPMI-1640不完全培養(yǎng)基，吹打、混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106/mL，接種至一次性塑料培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，使培養(yǎng)瓶底細(xì)胞分布均勻，轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔4小時(shí)觀察細(xì)胞的生長狀況，培養(yǎng)12 h細(xì)胞貼壁度達(dá)到較佳狀態(tài)時(shí)，取出至鏡下觀察。胎盤蘭染色法鑒定細(xì)胞活力均在95%以上，瑞氏-姬姆薩染色法鑒定巨噬細(xì)胞純度較高，在90%以上。運(yùn)用細(xì)胞免疫組化法，顯微鏡下檢測出細(xì)胞CD68抗體的陽性表達(dá)，即可定性鑒定為巨噬細(xì)胞。

1.4 脾臟巨噬細(xì)胞iNOS、ArgⅠmRNA表達(dá)的檢測 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。取出凍存的脾臟巨噬細(xì)胞，在37 ℃的水浴箱中復(fù)溫，隨后接種至一次性塑料培養(yǎng)瓶中，37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞用PBS液清洗、勻漿使核酸蛋白體完全解離、離心提取細(xì)胞的全部RNA，使用NanoDrop?ND-1000測定RNA的濃度和純度。按第一鏈cDNA合成試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：iNOS：F:5′TTGGAGCGAGTTGTGGATTG3′，R:5′TGAGGGCTTGCCTGAGTGA3′。Arg Ⅰ：F:5′AACGGGAAGGTAATCATAAGCC3′，R:5′GCCTGGTTCTGTTCGGTTTG3′。PCR反應(yīng)體系包括2 Master Mix 5 μL,F和R各0.5 μL，加水共8 μL，取cDNA 2 μL,反應(yīng)條件：95 ℃、10 s，60 ℃、60 s,40個(gè)循環(huán)。將熱應(yīng)激處理后不同時(shí)間點(diǎn)的各組細(xì)胞樣品分別進(jìn)行iNOS、ArgⅠ兩因子和GAPDH管家基因進(jìn)行PCR反應(yīng)。從機(jī)器中直接獲得待檢測因子的濃度結(jié)果，待測基因最終得到的相對濃度值可由管家基因給予校正，將機(jī)器自動生成的目的基因數(shù)值作為分子，各組樣品管家基因的數(shù)值作為分母，兩者相除后即可得到。

1.5 脾臟巨噬細(xì)胞iNOS、ArgⅠ蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blotting法。首先用蛋白質(zhì)抽提試劑提取大鼠脾臟巨噬細(xì)胞總蛋白，SDS-PAGE電泳法分離細(xì)胞蛋白質(zhì)，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%BSA溶液完全浸潤，加iNOS、ArgⅠ試劑盒中的一抗，4 ℃放置過夜，TBST緩沖液清洗5 min，共3次，滴加HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育60 min，TBST緩沖液清洗5 min，共3次。取KCTM試劑盒，兩試劑等量混合，放入PVDF膜，室溫下反應(yīng)3 min，固定，晾干，觀察結(jié)果。使用電腦Image J軟件自動分析檢測結(jié)果，將圖片上得到的條帶定量計(jì)算出所檢測的兩種目的蛋白的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 脾臟巨噬細(xì)胞的鑒定 顯微鏡下觀察細(xì)胞呈圓形或橢圓形，排列密集，界限清晰，胞質(zhì)內(nèi)容物豐富，富含顆粒狀物質(zhì)，呈嗜酸性胞質(zhì)。核仁呈圓形，清晰可見。免疫組化法測定巨噬細(xì)胞CD68抗體陽性表達(dá)。

2.2 各組iNOS、ArgⅠ表達(dá)比較 熱暴露即刻組，熱暴露后1、2、3、7 d組及對照組iNOS mRNA分別為0.071±0.020、0.045±0.020、0.059±0.02、0.026±0.005、0.171±0.086、0.129±0.270，ArgⅠmRNA分別為0.048±0.018、0.072±0.005、0.156±0.003、0.172±0.012、0.179±0.013、0.131±0.015。熱暴露即刻組，熱暴露后1、2、3、7 d組及對照組iNOS蛋白分別為0.208±0.087、0.168±0.074、0.116±0.039、0.076±0.012、0.282±0.086、0.468±0.145，ArgⅠ蛋白分別為0.210±0.032、1.196±0.243、1.259±0.121、1.346±0.332、1.408±0.103、0.832±0.109。與對照組iNOS mRNA及蛋白相比，除熱暴露后7 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，余各組均降低(P均<0.05)。與對照組ArgⅠmRNA及蛋白比較，熱暴露后1 d組低(P<0.05)，熱暴露后2 d、3 d、7 d組逐漸升高(P均<0.05)。

注：對-1，即-1,1-1,2-1,3-1,7-1分別代表對照組、熱暴露過后即刻組、熱暴露后1 d組、熱暴露后2 d組、熱暴露后3 d組、熱暴露后7 d組。

圖1iNOS、ArgⅠ在細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

3 討論

脾臟是機(jī)體最主要的免疫器官，調(diào)節(jié)機(jī)體的特異性及非特異性免疫反應(yīng)，在聯(lián)系循環(huán)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)間起著主要的橋梁作用。按組織結(jié)構(gòu)成分來說，白髓和紅髓共同構(gòu)成脾臟組織。白髓相當(dāng)于淋巴結(jié)的白質(zhì)，主要用于對抗外界微生物及感染應(yīng)激。紅髓主要用來儲存及過濾血液，分為脾索、脾血竇。巨噬細(xì)胞即附著于血竇的壁上，其具有強(qiáng)大的吞噬功能，可以吞噬、清除進(jìn)入血液中的病原體，如細(xì)菌、血吸蟲等，衰老紅細(xì)胞的清除也由其完成，除此之外，脾索中還包括有淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞。

巨噬細(xì)胞作為人體主要的免疫細(xì)胞，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。根據(jù)其所處的環(huán)境不同，巨噬細(xì)胞可表達(dá)不同的功能表型，包括經(jīng)典活化途徑激活的M1型和替代活化途徑激活的M2型。在脂多糖、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等因子的刺激下，巨噬細(xì)胞促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-12、ROS等細(xì)胞因子和CCR7、CXCL9等趨化因子的分泌，向M1型方向發(fā)生極化，發(fā)揮促進(jìn)炎性反應(yīng)、吞噬病原物的作用，加重機(jī)體炎性損傷。而在IL-4、IL-13和糖皮質(zhì)激素等的刺激下，巨噬細(xì)胞向M2型方向發(fā)生轉(zhuǎn)化，分泌抗炎因子IL-10和TGF-β、VEGF、EGF等，同時(shí)抑制IL-1、IL-6等促炎因子的分泌，發(fā)揮抗炎作用及減輕組織損傷。

在熱射病病理機(jī)制的研究中，Moseley等學(xué)者認(rèn)為當(dāng)機(jī)體受到外界熱應(yīng)激環(huán)境刺激時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，并發(fā)了內(nèi)毒素血癥，以脂多糖為主要成分的內(nèi)毒素可進(jìn)一步激活單核巨噬細(xì)胞釋放炎性因子，如TNF-α、IL-1等，進(jìn)一步引發(fā)全身炎性反應(yīng)及凝血功能障礙。發(fā)揮促炎功能的促炎因子如TNF-α、IL-1能同時(shí)誘導(dǎo)IL-6、IL-8等抗炎性因子的產(chǎn)生，機(jī)體內(nèi)的各種細(xì)胞因子之間相互作用、互相促進(jìn)，從而使各種因子的數(shù)量逐漸增加，形成一個(gè)龐大的細(xì)胞因子間的作用反應(yīng)體系，最終發(fā)展成級聯(lián)式的炎性反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征。多數(shù)國內(nèi)外學(xué)者在構(gòu)建熱射病模型后，均監(jiān)測到血液中各種細(xì)胞因子的大量分泌[2]。

巨噬細(xì)胞的極化方向與內(nèi)環(huán)境中炎性因子的分泌密切相關(guān)。單純構(gòu)建的動物熱射病模型和與脂多糖復(fù)合動物模型中，血液標(biāo)本的炎性因子均顯著增多，如TNF-α、IL-1、IL-6等。理論上，熱射病發(fā)生后機(jī)體迅速發(fā)生免疫反應(yīng)，大量的炎性細(xì)胞因子分泌，巨噬細(xì)胞向M1型方向極化。文獻(xiàn)[12]顯示，低溫環(huán)境促進(jìn)脂肪中巨噬細(xì)胞極化為M2型。有研究發(fā)現(xiàn)，低溫可通過IL-4/IL-13-Stat6信號通路的介導(dǎo)，誘導(dǎo)M2型細(xì)胞活化；進(jìn)一步通過分泌兒茶酚胺類激素促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)熱，維持體溫恒定，保護(hù)機(jī)體免受低溫的損害。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在熱射病發(fā)生后1 d，與M2型極化相關(guān)的ArgⅠ含量逐漸增加，提示向M2型方向轉(zhuǎn)變，起到抗炎作用、促進(jìn)機(jī)體功能恢復(fù)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，熱應(yīng)激即刻組兩種因子的表達(dá)量均減少，理論上熱應(yīng)激刺激炎性因子的分泌，促使巨噬細(xì)胞發(fā)生極化，然而兩種目的檢測因子的表達(dá)量均減少，考慮到機(jī)體遭受外界應(yīng)激刺激時(shí)巨噬細(xì)胞能夠迅速出現(xiàn)免疫反應(yīng)，極化現(xiàn)象的發(fā)生或許可能在熱射病超急性期出現(xiàn)。其次，本實(shí)驗(yàn)選取的時(shí)間點(diǎn)稍寬，熱應(yīng)激超過24 h后，大鼠能夠適應(yīng)性生存，也是細(xì)胞極化發(fā)生不明顯的一個(gè)考慮因素，后續(xù)試驗(yàn)可增加造模成功24 h內(nèi)的指標(biāo)測量。在1 d后同組ArgⅠ的表達(dá)即高于iNOS，起到保護(hù)機(jī)體的作用，是否由于離開高熱環(huán)境后機(jī)體的保護(hù)及適應(yīng)性的耐受有關(guān)，也是需要考慮的影響因素。

經(jīng)過對巨噬細(xì)胞分型的研究，諸多學(xué)者認(rèn)為機(jī)體內(nèi)環(huán)境的不穩(wěn)定性、體內(nèi)的代謝狀態(tài)等較多因素影響細(xì)胞的類型，使其不斷變化；實(shí)際情況下細(xì)胞的分型不是很明顯，M1、M2的分型是細(xì)胞處于功能狀態(tài)的兩個(gè)對立方面的表現(xiàn)，大多數(shù)細(xì)胞以兩者之間的某種或某些狀態(tài)存在[13]；同時(shí)，對兩種極化方向的細(xì)胞表面標(biāo)志物的研究也只是在一定層次水平上可以應(yīng)用，缺乏特異性。機(jī)體受到熱刺激后處于一個(gè)不平衡的內(nèi)環(huán)境，大量的炎性因子分泌，同時(shí)有少量的抗炎因子分泌，兩者之間既相互促進(jìn)又互為抑制，兩種因子的動態(tài)不平衡增加了本實(shí)驗(yàn)的難度。本實(shí)驗(yàn)種屬選取大鼠，相對于免疫學(xué)研究較常用的小鼠免疫反應(yīng)敏感性稍差。對指標(biāo)的檢測采用實(shí)時(shí)定量PCR、Western blotting兩種方法檢測巨噬細(xì)胞的極化發(fā)生，操作方法具有直接、易于分析的優(yōu)點(diǎn)，相對于國外采用的磁珠分選細(xì)胞法，此方法簡單，但干擾因素多。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)方法檢測。因受動物種屬來源的限制，測定大鼠來源細(xì)胞極化的抗體種類可選擇小，本實(shí)驗(yàn)選取iNOS、ArgⅠ兩個(gè)指標(biāo)，盡管已明確兩因子代表兩種極化方向，但其敏感性及本實(shí)驗(yàn)的方法學(xué)是否易于檢測出，也是本實(shí)驗(yàn)需繼續(xù)深究的地方。

總之，本研究從巨噬細(xì)胞極化方向來研究熱射病的治療具有很大的創(chuàng)新性，同時(shí)也是近年來免疫性、代謝性疾病研究新熱點(diǎn)。巨噬細(xì)胞極化的不平衡與機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化相關(guān)。即使是已經(jīng)極化為某一方向的巨噬細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變或受到其他因子的刺激時(shí)，仍可能向其對立方向發(fā)生極化。繼續(xù)深入研究巨噬細(xì)胞極化的發(fā)生，對于熱射病在炎性反應(yīng)方面的病理學(xué)機(jī)制研究有重要意義。進(jìn)一步通過對巨噬細(xì)胞極化的某些關(guān)鍵通路、影響因素等加以干預(yù)處理，改變巨噬細(xì)胞極化方向，為提高熱射病的治愈率、降低病死率，提供新的治療策略。