何濤,胡洪,謝楠,錢程,李春滿,唐波,付必莽,李文

(1玉溪市人民醫(yī)院，云南玉溪 653100;2昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院)

肝癌惡性程度極高，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，即使手術(shù)根治性切除，多數(shù)患者5年生存率仍不足20%[1]。新型共刺激分子B7-H4是近年新發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)性共刺激分子，參與腫瘤發(fā)生的多個(gè)過程，如細(xì)胞周期、增殖、凋亡等。研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4在正常組織中呈低表達(dá)或不表達(dá)，而在部分腫瘤中呈高表達(dá)[1～3]。2018年3～5月，首先我們篩選出高表達(dá)B7-H4的肝癌細(xì)胞株,并進(jìn)行慢病毒的轉(zhuǎn)染抑制，抑制肝癌細(xì)胞株B7-H4的表達(dá)量，以期觀察體外抑制該基因后對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肝癌細(xì)胞株Hep3B、SMMC-7721、Huh-7、PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3購自中科院昆明細(xì)胞庫。PBS(20×PBS Buffer)、TBS(20×TBS Buffer)購自上海生工生物工程有限公司。細(xì)胞裂解液及胰酶消化液購自上海翊圣生物科技有限公司。DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、蛋白定量試劑盒、二抗、ECL發(fā)光液及GAPDH單克隆抗體購自武漢谷歌生物科技有限公司。聚凝胺(Polybrene)購自吉滿生物科技(上海)有限公司。慢病毒(Lentivirus)載體設(shè)計(jì)合成與驗(yàn)證均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。目的基因shRNA-1序列:5′-GGATATCAAAGTGACAGAATC-3′，shRNA-2序列:5′-GGAAGTGAATGTGGACTATAA-3′。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒，CCK-8試劑盒購自江蘇凱基生物科技公司。B7-H4兔抗單克隆抗體購自美國Abcam公司及北京博奧森生物技術(shù)有限公司。多功能酶標(biāo)儀、ECL成像系統(tǒng)由Bio-Rad Laboratories科技公司提供。流式細(xì)胞儀由美國BD公司提供，型號為FACSCalibur型。

1.2 肝癌細(xì)胞培養(yǎng)、篩選及基因沉默 Hep3B、SMMC-7721、Huh-7三種細(xì)胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基、10% FBS培養(yǎng)，PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3三種細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基、10% FBS培養(yǎng)，以上細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基中加青-鏈霉素雙抗。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期且細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)，收取細(xì)胞蛋白，使用Western blotting法篩選出高表達(dá)B7-H4的細(xì)胞株。將該細(xì)胞株使用上述方法，改用24孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度合適時(shí)，行慢病毒轉(zhuǎn)染。將所培養(yǎng)的細(xì)胞隨機(jī)分為三組：對照組、shRNA-1組、shRNA-2組。培養(yǎng)并觀察細(xì)胞的生長情況，待細(xì)胞長至對數(shù)期且狀態(tài)良好，各組細(xì)胞融合率達(dá)75%時(shí)，行轉(zhuǎn)染操作。其中，shRNA-1組、shRNA-2組分別轉(zhuǎn)染對應(yīng)的B7-H4慢病毒抑制基因序列，對照組加轉(zhuǎn)染試劑但不予干擾序列。具體細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)染過程如下：①培養(yǎng)細(xì)胞并調(diào)整好細(xì)胞狀態(tài)，慢病毒轉(zhuǎn)染前一夜，將各肝癌貼壁細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并以1×105/孔鋪到24孔板中培養(yǎng)，并使各肝癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)的總量控制在2×105/孔。②慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)，先配制Polybrene試液，將原培養(yǎng)基用含有6 μg/mL Polybrene的新配培養(yǎng)基替換，并加入目標(biāo)基因病毒懸液，繼續(xù)培養(yǎng)。③4～6 h后，再加入1 mL新鮮培養(yǎng)基以稀釋轉(zhuǎn)染體系。④繼續(xù)培養(yǎng)約24 h，用新鮮培養(yǎng)基完全替代含有慢病毒液的培養(yǎng)基。⑤轉(zhuǎn)染48 h后，進(jìn)行熒光檢測(綠色熒光蛋白)，通常該熒光在72 h時(shí)最明顯。我們使用并收集轉(zhuǎn)染72 h時(shí)的各肝癌細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 慢病毒沉默B7-H4表達(dá)效率的檢測 采用Western blotting法。取各組轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞，刮取并裂解細(xì)胞提取蛋白，進(jìn)行蛋白定量測定。按照4∶1的比例取適量蛋白液和蛋白上樣緩沖液混勻，沸水加熱約10 min使蛋白變性。按目的蛋白分子大小配制WB膠版,并上樣目的蛋白液，每孔約30 μg，按110 V恒壓電泳、220 mA恒流條件轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間約100 min。然后將已經(jīng)轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于TBS-T緩沖液中漂洗約10 s，適宜比例條件下的脫脂牛奶封閉上述膜1 h備用，再孵育B7-H4抗體和內(nèi)參抗體，4 ℃條件下孵育過夜。第2天TBS-T緩沖液洗膜3次，每次10 min，TBS-T緩沖液洗膜1次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，再次按上述方式洗膜，曝光條帶并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察轉(zhuǎn)染慢病毒抑制后的各組目的蛋白表達(dá)情況，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，挑選出shRNA-2組HCCLM3肝癌細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 慢病毒抑制B7-H4基因?qū)CCLM3肝癌細(xì)胞增殖能力的影響 采用CCK-8法。取上述轉(zhuǎn)染72 h 細(xì)胞，按不低于1 000/孔接種在96孔板中培養(yǎng)，同時(shí)每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。按設(shè)定時(shí)間每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，然后在480 nm處測定各孔光密度(OD)值。并以實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果繪制細(xì)胞增殖曲線，統(tǒng)計(jì)分析目的基因抑制后細(xì)胞增殖能力的變化。

1.5 慢病毒抑制B7-H4基因?qū)CCLM3肝癌細(xì)胞凋亡率的影響 肝癌細(xì)胞HCCLM3經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染抑制1、2、3、4、5 d后，用胰酶消化液消化細(xì)胞(不含EDTA)，溫和吹打并收集細(xì)胞，確保細(xì)胞總量不低于10 000個(gè)，再用事先預(yù)冷的PBS洗滌上述細(xì)胞2～3次。按照凋亡試劑盒說明分次分組加入結(jié)合緩沖液、Annexin-V，再加入PI染液重懸細(xì)胞，室溫避光孵育10～30 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，并采用流式分析軟件FloMax 2.82版本分析實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組肝癌細(xì)胞B7-H4的相對表達(dá)量比較 Hep3B、SMMC-7721、Huh-7、PLC/PRF/5、HepG2、HCCLM3細(xì)胞的B7-H4表達(dá)量見圖1，可見6個(gè)細(xì)胞株中，HCCLM3的B7-H4相對表達(dá)量最高，為高表達(dá)B7-H4細(xì)胞株。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染后HCCLM3細(xì)胞B7-H4的表達(dá)情況 shRNA-1組、shRNA-2組B7-H4被抑制，且shRNA-2組抑制更明顯。見圖2。

圖1 不同肝癌細(xì)胞系中B7-H4表達(dá)

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后HCCLM3細(xì)胞B7-H4表達(dá)

2.3 抑制B7-H4表達(dá)對HCCLM3細(xì)胞增殖活性的影響 與對照組同時(shí)間比較，除轉(zhuǎn)染1 d細(xì)胞增殖活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，shRNA-2組HCCLM3細(xì)胞增殖活性降低(P均<0.05)。見表1。

2.4 抑制B7-H4表達(dá)對HCCLM3細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染后72 h，對照組凋亡率為9.63%，shRNA-2組凋亡率為43.3%，兩組比較，P<0.01。

表1 兩組細(xì)胞增殖活性比較

注:與對照組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0．05，**P<0．01。

3 討論

B7-H4是B7家族最新的新型共刺激分子，相對分子質(zhì)量約為31 kD，定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜，以往研究多關(guān)注其在免疫過程中的效應(yīng)。該分子在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)，在多個(gè)惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，肝、腎、肺等器官B7-H4蛋白不表達(dá)，但可檢測到相關(guān)mRNA的表達(dá)[1,2,4]。我們前期的研究中也發(fā)現(xiàn)，該蛋白在肝內(nèi)膽管癌、肝癌及結(jié)直腸癌等腫瘤中高表達(dá)，與多個(gè)相關(guān)研究[2]結(jié)果相符。通過多項(xiàng)基于該蛋白的研究，可表明機(jī)體對B7-H4基因的調(diào)控極有可能發(fā)生在翻譯水平。與此同時(shí)，B7-H4與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性表型以及腫瘤免疫密切相關(guān)[4]。

B7-H4調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡與多個(gè)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號分子及通路有關(guān)，我們在B7-H4與肝內(nèi)膽管癌關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，B7-H4與肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病密切相關(guān)，高表達(dá)的B7-H4可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，且促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促進(jìn)了細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，同時(shí)抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的凋亡。該過程的發(fā)生可能與Bcl-2/Bax比例失調(diào)有關(guān)，最終促使Caspase-3改變[2]。Qian等[5]研究發(fā)現(xiàn)，抑制該基因的表達(dá)，可增加細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，同時(shí)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)兩者的蛋白表達(dá)量及比例最終使Caspase-3、Caspase-9激活，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，抑制該基因后，可使細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2erk等的激活，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2,5]，與本研究結(jié)果相似。此外，在高表達(dá)B7-H4的非腫瘤細(xì)胞中，該基因的過表達(dá)可阻斷Fas/FasL信號通路途徑抑制相關(guān)細(xì)胞的凋亡[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，B7-H4與腫瘤細(xì)胞的增殖關(guān)系密切，過表達(dá)該基因可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的增殖能力。Zhang等[7]研究認(rèn)為，B7-H4可存在于細(xì)胞的多個(gè)部位，在細(xì)胞增殖過程中，可發(fā)生質(zhì)-核穿梭過程。多數(shù)研究者認(rèn)為，其基因內(nèi)包含核定位序列，同時(shí)該研究者也發(fā)現(xiàn)，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)部的B7-H4可影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin E/D1的表達(dá)，而兩者表達(dá)量的變化及相對比例影響細(xì)胞周期G/S期的轉(zhuǎn)變，并最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。Jeon等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將B7-H4轉(zhuǎn)染到人結(jié)腸癌SW-620及RKO細(xì)胞中，可發(fā)現(xiàn)上述兩種癌細(xì)胞的增殖速率明顯加快，且在裸鼠皮下荷瘤過程中，可發(fā)現(xiàn)過表達(dá)該基因的裸鼠具有明顯的生長優(yōu)勢。Cui等[9]用As2O3抑制肝細(xì)胞癌B7-H4的表達(dá)中，發(fā)現(xiàn)該基因被抑制后，JAK2/STAT3信號通路即可被抑制，并最終影響肝癌細(xì)胞的生長。另外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，B7-H4可通過誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子的激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和惡性進(jìn)展。同時(shí)，該研究指出高表達(dá)B7-H4促進(jìn)上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變，加速了腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。

B7-H4過表達(dá)不僅可促使腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)還可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。在肝內(nèi)膽管癌及結(jié)直腸癌中，我們應(yīng)用慢病毒抑制技術(shù)過表達(dá)及抑制該基因的表達(dá)，可發(fā)現(xiàn)相關(guān)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力的改變。同時(shí)也證明了結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化可能是PI3K/AKT通路激活所致[2,10～13]。部分研究者使用B7-H4-RNAi轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌LOVO細(xì)胞株后發(fā)現(xiàn)，CXCL-12趨化因子受體CXCR-4和JAK2/STAT3 mRNA的轉(zhuǎn)錄及相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，且其細(xì)胞侵襲能力下降[10]。該研究指出，B7-H4可通過調(diào)控上述細(xì)胞信號通路，并最終增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的轉(zhuǎn)變。我們在研究中亦發(fā)現(xiàn)，剔除裸鼠B7-H4基因可顯著抑制裸鼠肝內(nèi)肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移傾向[2]。

本研究發(fā)現(xiàn)，抑制B7-H4后，HCCLM3肝癌細(xì)胞凋亡率增加，而腫瘤細(xì)胞的低凋亡率是其惡性程度的最大體現(xiàn)，同時(shí)腫瘤細(xì)胞的增殖在目的基因被抑制后明顯降低。我們在實(shí)驗(yàn)中，亦發(fā)現(xiàn)shRNA-2組抑制B7-H4表達(dá)效率較好，抑制效果更加明顯，同時(shí)觀察分析shRNA-1組，可能有脫靶效應(yīng)的干擾。

綜上所述，慢病毒抑制HCCLM3肝癌細(xì)胞B7-H4表達(dá)可抑制該細(xì)胞增殖活性，加速該細(xì)胞凋亡，有望成為肝癌潛在的治療靶點(diǎn)及治療藥物研發(fā)新方向。