種宗雷,楊曉倩,肖以磊,呂甲濤,侯磊,許鵬,朱偉杰

(1 聊城市人民醫(yī)院腦科醫(yī)院，山東聊城252000；2濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院)

干細(xì)胞移植是治療脊髓損傷等神經(jīng)損傷性疾病的研究熱點，而移植入的干細(xì)胞異常衰老[1]一直是影響移植治療效果的難題。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷伴隨脊髓水腫進(jìn)一步減少血流[2]，脊髓損傷微環(huán)境中自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化作用造成神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的嚴(yán)重?fù)p傷，甚至使神經(jīng)功能永久性喪失[3]。自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，會損傷植入的干細(xì)胞[4，5]。2012年12月～2018年4月，本研究通過觀察人參皂苷Rg1對過氧化損傷人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)形態(tài)、增殖、衰老、細(xì)胞因子分泌、胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，探討Rg1對hUCMSCs有無保護(hù)作用及可能的作用機(jī)制，以提高干細(xì)胞對神經(jīng)損傷的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料 hUCMSCs由聊城市人民醫(yī)院中心實驗室提供。人參皂苷Rg1購自上海雅吉生物科技有限公司，純度大于95%;人腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司,β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒、CCK-8試劑盒、磷酸-p38分裂原激活的蛋白激酶(p-p38 MAPK)抗體、磷酸化應(yīng)激活化蛋白激酶(p-JNK/SAPK)抗體、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯色試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 hUCMSCs鑒定 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測hUCMSCs表面抗原。0.125%胰蛋白酶消化P5代細(xì)胞，加入PBS離心后去掉胰蛋白酶，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)1×109/L以上。將待檢細(xì)胞樣品分裝后,陰性對照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE，其他管分別加入鼠抗人CD105-FITC、CD29-PE、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-PE和CD34-PE，各20 μL，室溫孵育30 min后，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3 Rg1濃度篩選、細(xì)胞分組及處理 采用CCK-8比色法。取生長狀態(tài)良好的P5～P6代hUCMSCs，分別在不同Rg1濃度(0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)66 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度。將hUCMSCs分為陰性對照組(以3.3×105個/mL細(xì)胞密度接種到含50 ng/mL干細(xì)胞生長因子、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的培養(yǎng)基)，模型組(陰性對照組條件下培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá)80%時加入1.6 μmol/L H2O2)，Rg1低、中、高劑量組(模型組條件下培養(yǎng)30 min后，加入Rg1各0.5、4、32 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)36 h)，陽性對照組(模型組條件下培養(yǎng)30 min后，加入220 μmol/L維生素C，繼續(xù)培養(yǎng)36 h)。

1.4 細(xì)胞增殖活性的檢測 采用CCK-8比色法。96孔板中按分組每孔加入3.3×105/mL細(xì)胞懸液200 μL，培養(yǎng)細(xì)胞融合至80%時，加入CCK-8溶液20 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度(OD值)。

1.5 培養(yǎng)上清TNF-α水平檢測 采用ELISA法。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用人TNF-α ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)檢測。將TNF-α標(biāo)準(zhǔn)品加入稀釋液150 μL后，加于酶標(biāo)板孔底部，37 ℃溫育30 min，加滿洗滌液5次，加入酶標(biāo)試劑溫育、洗滌，加入顯色劑，37 ℃避光顯色15 min，加終止液，測量各孔的吸光度(OD值)。

1.6 衰老hUCMSCs百分比的檢測 采用β-半乳糖苷酶染色法。收集各組細(xì)胞，加β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10 min，PBS洗滌3次，每次3 min，加入染色工作液，37 ℃孵育20 min或更長時間，直至部分細(xì)胞的顏色變藍(lán)。通過400倍油鏡顯微鏡下觀察，在三個獨立的區(qū)域中計數(shù)超過400個細(xì)胞來計數(shù)β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞。

1.7 hUCMSCs中p-p38蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。各組細(xì)胞用固定液固定后，免疫染色洗滌液洗滌兩次，滴加封閉液3% H2O2封閉60 min；滴加p-p38 MAPK抗體(1∶500)，37 ℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加二抗，37 ℃孵育15 min，PBS沖洗;DAB顯色液3～5 min,顯微鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 6.0分析各蛋白的積分光密度值。

1.8 hUCMSCs中p-JNK蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blotting法。各組細(xì)胞(1×106個)加裂解液100 μL，冰上裂解30 min;細(xì)胞置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，收集上清；每孔上樣蛋白質(zhì)約40 μg，10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；封閉液室溫封閉1 h;分別加入p-JNK的多克隆抗體4 ℃過夜；加入二抗室溫孵育1 h;ECL試劑顯色，圖像分析系統(tǒng)分析各組的積分光密度值。

2 結(jié)果

2.1 hUCMSCs的鑒定結(jié)果 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示hUCMSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD105等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志。

2.2 Rg1對H2O2損傷的hUCMSCs增殖的影響 陰性對照組貼壁細(xì)胞明顯增大并分裂增殖，呈長梭形，可鋪滿板底。模型組僅有少量的細(xì)胞貼壁生長，邊緣圓潤。Rg1低劑量組僅有少量的細(xì)胞貼壁生長，邊緣較圓潤。Rg1中劑量組hUCMSCs長梭形。Rg1高劑量組貼壁細(xì)胞明顯增大并分裂增殖，呈長梭形，可鋪滿板底。陰性對照組、模型組、Rg1低劑量組、Rg1中劑量組、Rg1高劑量組、陽性對照組OD值分別為0.93±0.09、0.83±0.10、0.85±0.12、0.88±0.11、0.92±0.08、0.91±0.09，與陰性對照組相比，模型組、Rg各劑量組OD值降低(P均<0.05)；與模型組相比，Rg1低、中、高劑量組OD值逐級升高(P均<0.05)；與陽性對照組相比，Rg1高劑量組OD值增加(P<0.05)。與Rg1低、中劑量組比較，陽性對照組OD值升高(P均<0.05)。

2.3 各組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達(dá)比較 與陰性對照組相比，模型組、Rg1各劑量組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達(dá)升高(P均<0.05)；與模型組相比，Rg1低、中、高劑量組p-JNK蛋白、p-p38蛋白、TNF-α表達(dá)量逐級減小(P均<0.05)；與陽性對照組相比，Rg1高劑量組p-JNK蛋白、p-p38蛋白、TNF-α表達(dá)降低(P均<0.05)。與Rg1低、中劑量組比較，陽性對照組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達(dá)降低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組p-JNK、p-p38蛋白及TNF-α表達(dá)比較

2.4 各組衰老hUCMSCs百分比比較 陰性對照組、模型組、Rg1低劑量組、Rg1中劑量組、Rg1高劑量組、陽性對照組衰老hUCMSCs百分比分別為6.53%±0.51%、52.10%±4.20%、31.62%±1.87%、22.23%±3.10%、6.12%±0.41%、21.62%±1.57%。與陰性對照組相比，模型組、Rg1各劑量組衰老hUCMSCs百分比升高(P均<0.05)；與模型組相比，Rg1低、中、高劑量組衰老hUCMSCs百分比降低(P均<0.05)；與陽性對照組相比，Rg1高劑量組衰老hUCMSCs百分比減少(P<0.05)。與Rg1低、中劑量組比較，陽性對照組衰老hUCMSCs百分比減少(P均<0.05)。

3 討論

人參含有多種成分，各成分均有重要作用，如皂苷Rh2、Rg3抗腫瘤作用[6,7]，Rb1可促進(jìn)荷爾蒙分泌[8]、促進(jìn)生物合成、增強免疫力、保護(hù)細(xì)胞、抗疲勞、抗氧化等[8～11]。Rg1對干細(xì)胞的作用引起了廣泛關(guān)注，能夠顯著提升雪旺細(xì)胞等干細(xì)胞增殖、再生[12]，能夠促進(jìn)造血干祖細(xì)胞增殖[13]等。Rg1抗炎機(jī)制與大腦黑多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)密切相關(guān)，還能抑制補體誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷、細(xì)胞衰老、細(xì)胞內(nèi)的活性氧產(chǎn)生，降低p-p38蛋白表達(dá)。

臍帶MSCs與骨髓、臍血來源的MSCs相似，具有間充質(zhì)干細(xì)胞特征。臍帶MSCs具有多向分化潛能，不表達(dá)或低表達(dá)移植相關(guān)的細(xì)胞表面標(biāo)記，免疫原性低，使用不需經(jīng)過嚴(yán)格配型，同種異體移植無免疫排斥反應(yīng)或反應(yīng)較弱，適宜于不同個體之間的移植。使它在組織工程、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、心血管系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、視網(wǎng)膜疾病、糖尿病、腫瘤疾病等方面具有巨大的優(yōu)勢。

本實驗就Rg1對hUCMSCs增殖特性的影響進(jìn)行了研究，CCK-8檢測結(jié)果顯示Rg1各劑量對hUCMSCs的增殖有明顯促進(jìn)作用，而H2O2則明顯抑制hUCMSCs增殖，Rg1對H2O2抑制hUCMSCs增殖的效應(yīng)有明顯逆轉(zhuǎn)作用，且H2O2可明顯抑制Rg1對hUCMSCs的促增殖效應(yīng)。這一結(jié)果表明，Rg1對hUCMSCs增殖的作用明顯，H2O2也明顯抑制hUCMSCs的增殖，但Rg1可部分降低H2O2對hUCMSCs增殖的抑制作用。Rg1促進(jìn)造血干祖細(xì)胞增殖的作用及本實驗中Rg1促進(jìn)hUCMSCs增殖提示，Rg1在hUCMSCs促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生與功能恢復(fù)中有良好的輔助效果。

p38是MAPKs超家族的成員之一，在細(xì)胞分化信號通路、細(xì)胞衰老、應(yīng)激反應(yīng)和許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要作用[14]。JNKs家族是MAPKs超家族的另一個成員，JNK和(或)p38的活化促使炎癥反應(yīng)加重甚至細(xì)胞衰老[15,16]，與TNF-α炎性反應(yīng)產(chǎn)生密切相關(guān)。此外，通過激活p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以促進(jìn)氧化應(yīng)激的發(fā)生，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。p38 MAPK活化其下游通路可能導(dǎo)致干細(xì)胞周期停滯、衰老[17]。

本研究結(jié)果顯示，H2O2損傷的hUCMSCs中TNF-α的水平升高，推測這可能是H2O2損傷的hUCMSCs發(fā)生炎性反應(yīng)所致。我們加入Rg1后對hUCMSCs進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，Rg1各劑量組TNF-α、p-JNK和p-p38蛋白的表達(dá)降低，表明Rg1抑制H2O2損傷hUCMSCs導(dǎo)致的TNF-α、p-JNK和p-p38高活性，從而對H2O2損傷的hUCMSCs產(chǎn)生保護(hù)性作用，促進(jìn)過氧化損傷的修復(fù)。

綜上所述，Rg1可使hUCMSCs增殖增加，衰老細(xì)胞百分比減少，TNF-α、p-JNK、p-p38表達(dá)降低，表明Rg1可以對H2O2損傷的hUCMSCs產(chǎn)生保護(hù)性作用，促進(jìn)過氧化損傷的修復(fù)。