傅楊，夏西燕，李曉慧，莊學(xué)偉

(1 山東大學(xué)齊魯醫(yī)院，濟(jì)南250012；2 濟(jì)南市婦幼保健院；3 濟(jì)南護(hù)理職業(yè)學(xué)院)

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命健康的疾病，在全球范圍內(nèi)是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，盡管肺癌的診治水平不斷提高，但5年生存率仍然較低[1]。Syncytin-1是人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒W(wǎng)基因家族(HERVWE1)的成員，定位于染色體7q21-22[2]。體外實(shí)驗(yàn)的相關(guān)研究顯示，在多種人類惡性腫瘤中觀察到Syncytin-1的過(guò)度表達(dá)，包括乳腺癌[3]、子宮內(nèi)膜癌[4]、卵巢癌[5]、結(jié)直腸癌[6]、白血病和淋巴瘤[7]等。Syncytin-1與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的相關(guān)性國(guó)內(nèi)外少見報(bào)道，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了Syncytin-1在NSCLC癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，并探討了其與患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇山東大學(xué)齊魯醫(yī)院1999年1月～2001年10月收治并經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC的患者30例，其中男23例、女7例，年齡37～75(57.87±1.72)歲，鱗狀細(xì)胞癌16例，腺癌14例；TNM分期中Ⅰ期12例、Ⅱ期6例、Ⅲ期12例；出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移15例。術(shù)中取患者的癌組織及癌旁組織(癌組織旁1～2 cm)，離體后半小時(shí)內(nèi)用10%中性甲醛固定12～24 h，脫水、石蠟包埋、制片。

1.2 NSCLC癌組織及癌旁組織中Syncytin-1表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。將相應(yīng)的蠟塊切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，兔抗人Syncytin-1單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)GeneTex公司，抗兔IgG抗體購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。具體步驟為：①將適量的EDTA修復(fù)液加入高壓鍋內(nèi)，將電磁爐的功率調(diào)整至1 600 W對(duì)高壓鍋進(jìn)行預(yù)熱，待修復(fù)液沸騰后將切片放入鍋內(nèi)，并將電磁爐功率降至900 W，修復(fù)2.5 min，待修復(fù)液及切片冷卻至室溫后取出切片架，PBS沖洗3次，每次3 min；②滴加3% H2O2100 μL，以此阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的作用，37 ℃孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；③滴加一抗溶液(兔抗人Syncytin-1單克隆抗體1∶100稀釋)50 μL，室溫孵育2 h左右，PBS沖洗3次、每次3 min；④滴加試劑1(Polymer Helper)50 μL，37 ℃溫箱孵育20 min，PBS沖洗3次、每次3 min；⑤滴加二抗溶液(抗兔IgG)50 μL，室溫孵育30 min，PBS沖洗3次、每次3 min；⑥D(zhuǎn)AB溶液顯色3～5 min；⑦流水漂洗、復(fù)染、分色、返藍(lán)、脫水、透明、封片；⑧顯微鏡下觀察以評(píng)估染色質(zhì)量和結(jié)果，拍照。陽(yáng)性結(jié)果判定：Syncytin-1蛋白陽(yáng)性染色為細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)著棕黃色，細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染為藍(lán)色。染色結(jié)果分為四類：“-”組織標(biāo)本無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞；“+”組織標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞率<25%，著色較弱；“++”組織標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞率為25%～50%，著色適中；“+++”組織標(biāo)本的陽(yáng)性細(xì)胞率>50%，著色較深。Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率=著棕黃色的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)(蘇木精染成藍(lán)色)×100%。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC癌組織及癌旁組織中Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率比較 所有細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木精復(fù)染為藍(lán)色，而Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)被染成棕黃色，陰性的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)不著色。NSCLC癌組織及癌旁組織Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率分別為35.41%±0.22%、2.17%±0.03%，NSCLC癌組織中Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率高于癌旁組織(P<0.01)。見圖1。以Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率25%為界，陽(yáng)性細(xì)胞率≥25%的患者為Syncytin-1高表達(dá)組，陽(yáng)性細(xì)胞率<25%的患者為Syncytin-1低表達(dá)組,分別為19、11例。

圖1 NSCLC癌組織及癌旁組織中Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率

2.2 5年存活組和5年死亡組癌組織中Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率比較 5年存活組和5年死亡組Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率分別為23.30%±0.16%、44.67%±0.21%。5年存活組Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率低于5年死亡組(P<0.01)。見圖2。

2.3 生存分析 Syncytin-1低表達(dá)組5年內(nèi)死亡3例，占27.3%；Syncytin-1高表達(dá)組5年內(nèi)死亡14例，占73.7%，Syncytin-1高表達(dá)組中的死亡比例高于Syncytin-1低表達(dá)組(P<0.05)。Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，Syncytin-1高表達(dá)組平均生存期為28個(gè)月，而Syncytin-1低表達(dá)組為64個(gè)月，兩組比較，P<0.01。見圖3。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果顯示，Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率和臨床分期是NSCLC死亡的危險(xiǎn)因素(P均<0.05)。見表1。

圖2 5年存活組和5年死亡組Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率

圖3 Syncytin-1高表達(dá)與低表達(dá)患者生存曲線(Kaplan-Meier法)表1 NSCLC患者多變量Cox回歸分析結(jié)果

變量 HR 95%CI PSyncytin-1 7.824 1.138～53.814 0.037性別 0.678 0.176～2.617 0.573年齡 0.639 0.179～2.273 0.489原發(fā)腫瘤 1.258 0.506～3.126 0.621區(qū)域淋巴結(jié) 0.449 0.160～1.263 0.129臨床分期 8.158 2.211～30.093 0.002

3 討論

功能性的HERVWE1包括完整的長(zhǎng)末端重復(fù)序列的非編碼區(qū)和組特異性抗原、聚合酶、包膜(env)基因，只有全長(zhǎng)env基因可以編碼出有功能性的糖蛋白即Syncytin-1，由538個(gè)氨基酸組成。Syncytin-1已經(jīng)進(jìn)化為人類胎盤形態(tài)發(fā)生所必需的基因，借助于細(xì)胞融合功能將細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合成合體滋養(yǎng)層細(xì)胞[2]。在我國(guó)，肺癌已成為癌癥死亡的首要病因，且發(fā)病率和病死率還在不斷增長(zhǎng)。最新資料表明，美國(guó)2010年新發(fā)腫瘤患者150多萬(wàn)，其中肺癌患者22萬(wàn)余例，約占總數(shù)的15%，居各類癌癥之首[8]。在美國(guó)肺癌已經(jīng)是癌癥患者死亡的主要原因，約75%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于中、晚期，所有階段的5年生存率為15.6%，包括手術(shù)、化療、放療干預(yù)在內(nèi)的治療對(duì)原發(fā)性肺部惡性腫瘤患者的長(zhǎng)期存活率大多沒有改善作用[9]。NSCLC約占原發(fā)性肺癌的85%[10]，預(yù)后很差。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多階段多因素的結(jié)果，其中包括癌基因的激活和抑癌基因的失活，有些在胎兒期才表達(dá)的蛋白質(zhì)在患癌后顯著升高，如癌胚抗原和甲胎蛋白等。

據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，Syncytin-1在多種人類癌癥組織中有異常表達(dá)。Strissel等[4]發(fā)現(xiàn)，與早期和高分化癌癥相比，Syncytin-1在晚期和低分化的子宮內(nèi)膜癌中過(guò)度表達(dá)。Larsson等[3]分析165例絕經(jīng)前期淋巴結(jié)陰性的乳腺癌患者腫瘤組織中Syncytin的表達(dá)情況，其中38%的乳腺癌患者為陽(yáng)性。Sun等[7]發(fā)現(xiàn)，Syncytin-1在急性髓細(xì)胞白血病中表達(dá)增加，并且Syncytin-1在四種白細(xì)胞(即原始細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)中表達(dá)均增加。Maliniemi等[11]還發(fā)現(xiàn)，在蕈樣真菌病活組織檢查中存在Syncytin-1蛋白的表達(dá)，并且在惡性淋巴細(xì)胞中也有表達(dá)，特別是表皮性的惡性淋巴細(xì)胞中，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)法證明，在NSCLC組織中有中至高等強(qiáng)度的Syncytin-1蛋白表達(dá)，而在癌旁組織中多不表達(dá)，這與Syncytin-1在其他人類惡性腫瘤組織中的表達(dá)報(bào)道一致。影響肺癌5年生存率的因素是多方面的，需要根據(jù)患者的全身情況、心理狀態(tài)、腫瘤分期、組織學(xué)類型、惡性程度以及有無(wú)轉(zhuǎn)移等因素綜合考慮。Larsson等[3]報(bào)道，Syncytin表達(dá)較強(qiáng)的乳腺癌患者有更高的無(wú)復(fù)發(fā)生存率，并且可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。Larsen等[6]對(duì)140例結(jié)直腸癌病例進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)Syncytin在結(jié)直腸癌中均有表達(dá)，但在直腸癌中Syncytin表達(dá)增加伴隨著總體生存率的下降，而在結(jié)腸癌中并無(wú)此現(xiàn)象。本研究顯示，Syncytin-1在5年死亡組的表達(dá)高于5年存活組，提示Syncytin-1可以作為NSCLC的預(yù)后指標(biāo)，表達(dá)高則預(yù)后不良。Syncytin-1高表達(dá)組死亡患者比例高于Syncytin-1低表達(dá)組，平均生存期低于Syncytin-1低表達(dá)組。我們將Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率、患者性別、年齡、腫瘤的TNM分期以及臨床分期等諸多因素納入Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，結(jié)果顯示Syncytin-1陽(yáng)性細(xì)胞率和臨床分期是NSCLC死亡的危險(xiǎn)因素。上述這些研究成果提示 Syncytin-1與NSCLC患者預(yù)后有關(guān)。

最新證據(jù)表明，Syncytin-1是一種多功能的蛋白質(zhì)。癌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)Syncytin-1的受體ASCT2，抗Syncytin-1治療降低了Syncytin-1的表達(dá)，并抑制了內(nèi)皮細(xì)胞與乳腺癌細(xì)胞之間的融合，這表明Syncytin-1與腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的融合有關(guān)[12]。除細(xì)胞融合功能外，Syncytin-1還具有一些重要的非融合功能，Syncytin-1參與免疫抑制，可能有助于母體適應(yīng)懷孕過(guò)程[13]。Syncytin-1在TGF-β1和TGF-β3存在的情況下可促進(jìn)細(xì)胞增殖，這表明Syncytin-1是細(xì)胞增殖過(guò)程所必需的[14]。胎盤滋養(yǎng)層的生存似乎依賴于足夠水平的Syncytin-1，因?yàn)榍脺pSyncytin-1會(huì)誘導(dǎo)廣泛的細(xì)胞凋亡[15]。在病理?xiàng)l件下，Syncytin-1表達(dá)的下降可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡和滋養(yǎng)細(xì)胞脫落，這是在先兆子癇胎盤中經(jīng)常觀察到的現(xiàn)象[16]。這些非融合功能(免疫抑制、細(xì)胞增殖、抗凋亡)可以被用來(lái)解釋Syncytin-1在人類惡性腫瘤組織中過(guò)度表達(dá)的原因。

總之，Syncytin-1在NSCLC組織中過(guò)度表達(dá)，且與患者的預(yù)后有關(guān)，此為肺癌的診斷、治療、預(yù)后判斷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為NSCLC發(fā)病機(jī)制的探索揭開了新的曙光，但Syncytin-1的病理生理功能以及在NSCLC中的表觀遺傳調(diào)控的確切分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探討。