王勤，吳波，張建華，李玉前，周曉中，王新巒

(1南通市第三人民醫(yī)院，江蘇南通226001；2蘇州大學附屬第二醫(yī)院；3中科院深圳先進技術研究院轉化醫(yī)學中心)

射線應用于臨床已有較長時間[1]，尤其骨折患者治療前后都要受到X射線照射。中高劑量的X射線抑制骨髓細胞增殖分化同時,對骨髓細胞具有殺傷作用，可導致骨折延遲愈合甚至放射性骨壞死[2]。低劑量X射線有著完全不同的作用，我們前期通過構建大鼠股骨橫行骨折模型，低劑量X射線能夠促進骨折愈合過程中硬骨痂期骨痂礦化，從而促進骨折愈合[3]。骨折愈合過程包含復雜的重建與修復過程，骨痂形成對于骨重建起關鍵作用，而成骨細胞的分化和礦化對骨痂形成尤其重要。進一步研究顯示,低劑量X射線上調成骨細胞相關因子(Runx2)與骨鈣素(OCN)表達，進而促進成骨細胞分化與礦化[4]；而成骨細胞增殖、分化、凋亡及轉型的過程涉及多條信號通路，骨形態(tài)蛋白2(BMP-2)/Smads信號通路是成骨細胞分化及細胞外基質合成、分泌所必需的[5]。2015年6月～2018年2月，本研究從BMP-2/Smads信號通路角度，探討低劑量X射線促進成骨細胞分化和礦化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠UMR-106細胞(成骨細胞)(美國，ATCC)，CCK-8試劑盒(DOJINDO,日本)，ALP試劑盒(碧云天公司)，茜素紅(美國，Sigma)，十六烷基吡啶(美國，Alpha公司)，ReverTra Ace qPCR RT Kit(TOYOBO公司)，SYBR@Green Realtime PCR Master Mix Reagent(TOYOBO公司), Anti-BMP-2抗體、Anti-Smads(1/5/4)抗體、Anti-Runx2抗體、Anti-Osterix 抗體(Abcam公司)，ELISA試劑盒(Uscn Life Science Inc)，NOGGIN(Peprotech公司)。醫(yī)用直線加速器(美國，Siemens Primus公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理 成骨細胞培養(yǎng)按照余墨聲等[6]方法，隨機分為照射組與對照組，培養(yǎng)48 h后，照射組給予單次0.1 Gy劑量X射線照射，對照組置于同樣環(huán)境下不照射；另取成骨細胞分為0.1 Gy組、0.1 Gy拮抗劑組、control組及control拮抗劑組。0.1 Gy組、control組處理同上，兩個拮抗劑組分別在0.1 Gy組及control組的基礎上加入濃度為10 μg/mL的NOGGIN拮抗劑0.5 mg。

1.3 細胞增殖活性的檢測 采用CCK-8法。用1×103/孔鋪96孔板，培養(yǎng)48 h后，分別于照射后24、48、72 h，每孔加入培養(yǎng)基100 μL，CCK-8 10 μL，37 ℃孵育1 h，檢測前每孔中加入1% w/v十二烷基磺酸鈉終止液10 μL，多功能酶標儀檢測450 nm吸光度值(A值)。

1.4 成骨細胞內ALP的檢測 成骨細胞以1×104/孔鋪48孔板，培養(yǎng)48 h后照射，照射后24、48、72 h提取總蛋白。用4 ℃ PBS沖洗3次，每孔加入蛋白裂解液100 μL ，并于冰上溶解20 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后提取上清。稀釋后取上清液50 μL與顯色底物反應液50 μL反應，利用標準品p-nitro phenol(10 mmol/L)制作標椎曲線，在37 ℃中孵育5 min，每孔加入反應終止液100 μL，多功能酶標儀405 nm處檢測樣品OD值，再利用樣品OD值在ALP標準曲線上讀取酶的活性值(U/L)。

1.5 成骨細胞礦化的檢測 成骨細胞以10×104個細胞每孔鋪6孔板，培養(yǎng)48 h后照射，取照射后24、48和72 h后兩組的成骨細胞，1%茜素紅染色劑進行成骨細胞鈣結節(jié)的染色并拍照，每孔加入10%十六烷基吡啶1 mL常溫30 min后，將溶解液加入到96孔板，多功能酶標儀562 nm處檢測A值。

1.6 成骨相關基因的檢測 總RNA提?。阂?×104個細胞每孔鋪48孔板，培養(yǎng)48 h后照射，取照射24、48、72 h后兩組的成骨細胞，每孔加入TRIzol 100 μL 裂解。RT-PCR：逆轉錄獲得cDNA條件：65 ℃、5 min，冰水浴5 min，37 ℃、15 min，98 ℃、5 min。引物序列：BMP-2:上游引物5′- CCAGGTTAGTGACTCAGAACAC-3′，下游引物 5′-TCATCTTGGTGCAAAGACCTGC-3′；Smad1:上游引物5′-AAGGTGGGGAAAGTGAAAC-3′，下游引物 5′-CTGCTTGGAACCAAATGGGAA-3′;Smad5:上游引物5′-GGAACCTGAGCCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTTGCTGGGGAGTTGGGATA-3′;Smad4:上游引物5′-GTAGTAGGAGATGGAGCAC-3′，下游引物 5′-ATGCTTTAGTTCATTCTTGTG-3′;Runx2：上游引物5′-TAACGGTCTTCACAAATCCTC-3′，下游引物 5′-GGCGGTCAGAGAACAAACTA -3′;Osterix:上游引物5′-CAATGACTACCCACCCTTTCC-3′，下游引物5′- TGCCCACCACCTAACCAA -3′;OCN：上游引物5′-CACAGGGAGGTGTGTGAG-3′，下游引物5′-TGTGCCGTCCATACTTTC-3′;GAPDH：上游引物5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物5′- GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′)。cDNA稀釋10倍后上300 ng的模板DNA；擴增體系20 μL：蒸餾水6.4 μL、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix reagent 10 μL、上游引物(10 μmol/L)0.8 μL、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL、cDNA模板2 μL，擴增步驟：預變性95 ℃、30 s；45個循環(huán)，95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min。用2-ΔΔCT法行mRNA表達的CT值分析,以目的基因的相對表達量用于統(tǒng)計分析。

1.7 OCN蛋白的檢測 采用ELISA法。成骨細胞以1×104/孔鋪48孔板，培養(yǎng)48 h后，0.1 Gy組、control組及相應拮抗劑組進行相應處理，72 h后提取培養(yǎng)基4 ℃、12 000 r/min、10 min離心后取各組上清液。按照OCN試劑盒說明操作，利用酶標儀在450 nm波長下測定標準品吸光度(OD值)并制作標準曲線，再將樣品測出各組吸光度，利用標準曲線計算出相應的濃度。

1.8 成骨相關蛋白的檢測 采用Western blotting法。以10×104個細胞每孔鋪6孔板，培養(yǎng)48 h后，0.1 Gy組、control組及相應拮抗劑組進行相應處理，72 h后取各組總蛋白，上樣為50 μg，加入25%的上樣緩沖液(Loading Buffer)后98 ℃變性10 min，10%聚丙酰胺凝膠電泳，濕法轉膜，4 ℃ 5%牛奶過夜。含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(PBST)清洗3次后，加入1∶1 000稀釋的小鼠抗大鼠抗體懸液，室溫置于搖床上2 h，PBST清洗3次后，加入1∶5 000稀釋的辣氧化根山羊抗小鼠的抗體液，室溫置于搖床上2 h，PBST清洗3次后，加A+B混合發(fā)光液1 mL顯影，用Image J軟件對Western blotting條帶進行灰度分析，測量出灰度值(ID)。

2 結果

2.1 兩組細胞增殖活性比較 對照組照射后24、48、72 h成骨細胞A值分別為0.40±0.02、0.99±0.05、1.81±0.21，照射組分別為0.39±0.02、0.98±0.07、1.74±0.19，兩組不同時間A值比較，P均>0.05。

2.2 兩組ALP活性比較 對照組照射后24、48、72 h成骨細胞ALP分別為(2.439±0.096)、(4.750±0.050)、(3.306±0.531)U/L，照射組分別為(2.841±0.047)、(5.890±0.150)、(3.762±0.675)U/L。照射后24 h，兩組ALP活性比較，P>0.05；照射后48、72 h，與對照組比較，照射組ALP活性升高(P<0.01或<0.05)。

2.3 兩組骨礦化比較 照射后24、48 h，照射組與對照組比較礦化結節(jié)染色肉眼下無明顯區(qū)別；照射后72 h，照射組礦化結節(jié)染色后肉眼下多于對照組。對照組照射后24、48、72 h成骨細胞的礦化A值分別為0.470±0.039、1.947±0.179、5.391±0.307，照射組分別為0.611±0.044、1.944±0.070、6.537±0.228；照射后24、48 h，照射組與對照組礦化A值比較，P>0.05；照射后72 h，照射組礦化A值高于對照組(P<0.01)。

2.4 各組成骨相關基因相對表達量比較 照射后24 h，照射組BMP-2、Smad1、Smad5、Smad4、Runx2、Osterix及OCN mRNA相對表達量與對照組比較，P均>0.05；照射后48 h，照射組各指標均高于對照組(P<0.05或<0.01)；照射后72 h，照射組Smad1 mRNA相對表達量高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.5 各組成骨相關蛋白相對表達量比較 照射后72 h，0.1 Gy組BMP-2、Smad1、Smad4、Smad5、Runx2、Osterix及OCN蛋白相對表達量高于control組(P均<0.05)；兩個拮抗劑組各指標均下降，兩組間各指標比較,P均>0.05。見表2。

3 討論

細胞的生長倍增時間和生長曲線是反映細胞增殖活力的重要標志，通過準確地檢測細胞倍增時間和觀察細胞的生長曲線可以檢測細胞的增殖能力[7]。在本研究中，照射后24、48、72 h，分別檢測了照射組與對照組成骨細胞的A值，成骨細胞隨著時間推移呈現倍數增長，表明細胞處于對數生長期，各個時間點相互比較A值差異無統(tǒng)計學意義，表明低劑量X射線對對數生長期成骨細胞的增殖無明顯促進作用。

表1 各組成骨相關基因相對表達量比較

注：與對照組同時點比較，*P<0.05,**P<0.01。

表2 各組成骨相關蛋白相對表達量比較

ALP活性及礦化能力是成骨細胞不同階段分化的重要標志[8]。ALP為成骨細胞早期分化并具有骨形成功能的重要生物學標志物[9]。本研究中，照射組與對照組在ALP活性和礦化量上比較均明顯增加，照射后48 h,ALP活性達到高峰；照射后72 h，成骨細胞礦化達到高峰，與Luckey等[10]研究發(fā)現的低劑量X射線促進生物生長、發(fā)育及增強免疫的興奮效應相一致；同時成骨細胞分化與礦化有時間先后順序，表明低劑量X射線促進成骨細胞分化及礦化符合骨折愈合過程中骨痂礦化時間依賴性的生理過程。

在骨組織形成過程中，BMP-2通過自分泌與旁分泌作用，在細胞及細胞間質之間傳導信息，調節(jié)成骨細胞的分化[11]。Welch等[12,13]發(fā)現,重組BMP-2蛋白在活體和離體實驗中都能促進成骨細胞分化。本研究發(fā)現，照射后48 h，低劑量X射線促進成骨細胞BMP-2 mRNA的表達；照射后72 h，低劑量X射線增加成骨細胞BMP-2蛋白的分泌，提示低劑量X射線通過BMP-2促進成骨細胞分化有時間依賴效應，表明單次的低劑量X射線是通過激發(fā)成骨細胞自身的自分泌/旁分泌作用繼而促進下游蛋白進一步表達發(fā)揮效應的。成骨細胞的分化涉及多條信號通路，其中BMP-2/Smads/Runx2/Osterix途徑對成骨細胞分化及細胞外基質形成有非常重要作用。因此我們假設低劑量X射線可能是通過激活BMP-2/Smads信號通路調控下游成骨基因的表達進而發(fā)揮作用。本研究結果顯示，在照射后48 h，低劑量X射線上調了Smad1/5/4、Runx2、Osterix和OCN mRNA的表達；照射后72 h，低劑量X射線上調了Smad1/5/4、Runx2、Osterix和OCN蛋白的表達，表明上述基因與蛋白的表達作用與BMP-2對成骨細胞分化與礦化的時間依賴作用相一致。BMP通過激活Smads信號傳導，從而誘導Runx2基因表達[14]。Javed等[15]發(fā)現，Smads與Runx2相互作用可誘導成骨細胞分化，而Osterix是Runx2的靶基因，受到Runx2的轉錄調控[16]。由此為了證實單次低劑量X射線通過刺激成骨細胞分泌BMP-2蛋白，進而激活BMP-2/Smads信號途徑發(fā)揮作用。我們應用NOGGIN拮抗劑，在照射后72 h，檢測BMP-2、Smad1/5/4、Runx2、Osterix和OCN蛋白的表達與未加拮抗劑比較上述各指標表達均下降，其中0.1 Gy拮抗劑組與control拮抗劑組上述各指標表達差異無統(tǒng)計學意義。提示低劑量X射線可上調成骨細胞BMP-2蛋白表達，通過其自分泌/旁分泌方式激活細胞Smads信號通路，進而調控下游成骨基因的表達，從而促進成骨細胞分化與礦化。