何海蕾,嚴(yán)俊峰,王羽,劉建偉

(1贛州市人民醫(yī)院,江西贛州341002;2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院)

頭頸鱗癌指發(fā)生于耳鼻喉及口腔頜面部的鱗狀細(xì)胞癌，總體發(fā)病率位居所有惡性腫瘤的第6位，其中，口腔鱗癌是發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤[1]。據(jù)報(bào)道，全美境內(nèi)每年新增約5萬例口腔鱗癌患者，約1萬例患者因此死亡；而全球范圍內(nèi)，每年新增約30萬例，死亡約14.5萬例[2]。盡管近年包含外科手術(shù)治療、放療、化療及其他輔助治療手段的口腔鱗癌臨床治療技術(shù)取得了長足進(jìn)步，患者的五年生存率仍未突破50%[3]。一般認(rèn)為，影響患者預(yù)后的主要原因在于不受控制的組織轉(zhuǎn)移與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[4]。組蛋白賴氨酸去甲基化酶(KDM)自2004年被發(fā)現(xiàn)以來，已被證明在多種癌癥組織中異常表達(dá)[5]。近來許多研究將KDM作為腫瘤研究的一個(gè)突破口。KDM4A(或被稱為JMJD2A、JHDM3A)是一種含有JmjC結(jié)構(gòu)域的去甲基酶，屬于KDM4家族[6]。與其他KDM4家族成員相同，KDM4A對特定基因的轉(zhuǎn)錄具有促進(jìn)或抑制的調(diào)控作用[7]，因此能夠參與特定惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。本研究探討了KDM4A在口腔鱗癌組織中的表達(dá)變化及其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年7月～2016年12月贛州市人民醫(yī)院口腔頜面外科收治的口腔鱗癌患者110例，均術(shù)后經(jīng)病理科確診為口腔鱗癌。其中，男76例、女34例，年齡26～75歲、中位年齡53.21歲；TNM分期：Ⅰ期46例，Ⅱ～Ⅲ期64例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移51例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例；腫瘤高分化67例，低、中分化43例，術(shù)前未經(jīng)放、化療及其他抗腫瘤方式治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)性口腔鱗狀細(xì)胞癌；術(shù)前未經(jīng)放、化療及其他抗腫瘤手段治療；年齡≤75周歲；臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；伴有嚴(yán)重代謝性疾病或全身感染性疾??；嚴(yán)重肝腎功能不全等。另取癌旁正常組織(距離癌組織>5 cm)21例份作為對照。經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 組織KDM4A表達(dá)的檢測 采用免疫組化法。將手術(shù)切取的標(biāo)本以4%甲醛溶液固定，石蠟包埋。利用全自動(dòng)組織芯片儀(MITOGEN@000139)制作石蠟組織芯片。常規(guī)4 μm連續(xù)切片，裝片。采用Envision二步法染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以兔抗人KDM4A多克隆抗體Abnova(上海煊翎生物科技有限公司)為一抗，自身為陽性對照；陰性對照采用PBS為一抗。染色結(jié)果判定：每份樣本取400倍光學(xué)高倍鏡下4個(gè)至少含有100個(gè)細(xì)胞的不同視野，計(jì)分取算術(shù)平均數(shù)。將免疫組化染色結(jié)果按染色、計(jì)數(shù)分為兩部分，其評分標(biāo)準(zhǔn)分別為：染色計(jì)分：無色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，黃色至淺棕色計(jì)2分，棕色計(jì)3分；計(jì)數(shù)計(jì)分：<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，>25%～50%計(jì)2分，>50%計(jì)3分。計(jì)算染色計(jì)分與計(jì)數(shù)計(jì)分的乘積，以≤4視為陰性表達(dá)，≥6視為陽性表達(dá)。

1.3 隨訪 以患者術(shù)后出院為觀察起點(diǎn)，結(jié)合復(fù)診病歷，利用電話、電子通訊等手段對患者及其家屬進(jìn)行隨訪，隨訪截止于2017年9月，隨訪時(shí)長9～62(32.78±14.84)個(gè)月。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，預(yù)后評估采用Kaplan-Meier生存曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 口腔鱗癌組織及癌旁正?？谇火つそM織中KDM4A表達(dá)的比較 口腔鱗癌組織中KDM4A陽性表達(dá)率為51.82%(57/110)，癌旁正?？谇火つそM織中KDM4A陽性表達(dá)率為9.52%(2/21)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.723，P<0.05)。將口腔黏膜癌患者按照KDM4A表達(dá)情況分成KDM4A表達(dá)陽性組(57例)與KDM4A表達(dá)陰性組(53例)。

2.2 KDM4A在口腔鱗癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 口腔鱗癌組織中KDM4A的表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙史、飲酒史、腫瘤組織分化程度均無關(guān)(P均>0.05)，與TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P均<0.05)。見表1。

表1 KDM4A在口腔鱗癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

2.3 KDM4A在口腔鱗癌組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 KDM4A表達(dá)陰性組患者生存率為60.38%(32/53)，平均生存時(shí)間為(44.49±2.43)個(gè)月；KDM4A表達(dá)陽性組患者生存率為17.54%(10/57)，平均生存時(shí)間為(33.74±2.31)個(gè)月。兩組生存率與生存時(shí)間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.348，P<0.05；t=23.785，P<0.05)。見圖1。

3 討論

口腔鱗癌的發(fā)生與多種因素相關(guān)，目前已知的重要影響因素有吸煙、酗酒以及HPV感染[8]。由于發(fā)生部位的特殊性，對口腔鱗癌的治療方式選擇有限，且實(shí)時(shí)監(jiān)控、調(diào)整治療方案的難度非常高。因此找尋口腔鱗癌特異性無創(chuàng)診斷、預(yù)后手段可能是改善臨床診療方案、提高患者預(yù)后的一個(gè)方向。轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子KDM4A基因所編碼的蛋白含有一個(gè)復(fù)合活性中心，兩個(gè)PHD鋅指結(jié)構(gòu)域，其中PHD鋅指結(jié)構(gòu)域的作用尚不明確[9]。目前研究認(rèn)為，KDM4A通過對H3K9me3的去甲基化作用，使其形成開放染色質(zhì)狀態(tài)，使轉(zhuǎn)錄因子等更容易接近并結(jié)合相應(yīng)DNA，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[10]。而基因的表達(dá)異常通常被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生與發(fā)展的重要因素之一。

圖1 KDM4A表達(dá)陽性組與陰性組患者的生存曲線

Chu等[11]發(fā)現(xiàn)，KDM4A在前列腺癌中明顯表達(dá)異常，當(dāng)研究者用特異性小分子阻斷劑抑制KDM4A表達(dá)時(shí)，前列腺淋巴結(jié)癌細(xì)胞呈現(xiàn)出增殖抑制與凋亡增加現(xiàn)象。后續(xù)的研究[12]表明，當(dāng)KDM4A被特定的shRNA敲除，前列腺細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，而細(xì)胞凋亡則顯著增加，但這種效應(yīng)并不表現(xiàn)于永生化的前列腺上皮細(xì)胞。Qiu等[13]對子宮內(nèi)膜癌組織的研究表明，KDM4A在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)也異常提高，且與雄激素受體的表達(dá)在低雄激素細(xì)胞系中呈正相關(guān)。Li等[14]發(fā)現(xiàn)，KDM4A在導(dǎo)管癌組織中的表達(dá)異常升高，且其表達(dá)與p53、雌激素受體的表達(dá)正相關(guān)。而在與性激素?zé)o關(guān)的惡性腫瘤，例如肝癌[15]、非小細(xì)胞肺癌[16]等，KDM4A同樣出現(xiàn)表達(dá)異常升高的現(xiàn)象。因此，KDM4A能夠參與調(diào)控性激素信號(hào)通路依賴性基因與非性激素信號(hào)通路依賴性基因。研究[17]表明，KDM4A至少能影響細(xì)胞周期素D1與c-Jun兩種癌基因的表達(dá)。

本研究發(fā)現(xiàn)，KDM4A在口腔鱗癌組織中的表達(dá)異常升高，這表明KDM4A同樣能夠影響與口腔鱗癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的癌基因。而KDM4A表達(dá)僅與患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明KDM4A對口腔鱗癌組織中腫瘤細(xì)胞可能具有與前列腺癌細(xì)胞類似的作用，即促進(jìn)其增殖、轉(zhuǎn)移，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲力。KDM4A表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的組織分化程度無關(guān)，提示KDM4A并不參與細(xì)胞的分化。KDM4A表達(dá)與患者的性別無關(guān)，則表明KDM4A在口腔鱗癌中影響的癌基因與性激素信號(hào)通路無明顯相關(guān)性。KDM4A表達(dá)與通常認(rèn)為的致癌因素如煙、酒無關(guān)，則表明其影響的基因受煙酒影響較小。本研究后續(xù)對患者的隨訪結(jié)果表明，KDM4A表達(dá)陽性組的患者預(yù)后差于陰性組患者，提示對于KDM4A表達(dá)陽性患者，后續(xù)應(yīng)加強(qiáng)監(jiān)測，適當(dāng)配合放療、化療等其他治療手段以提高患者預(yù)后；而對于KDM4A表達(dá)陰性患者，則應(yīng)在保持復(fù)診的同時(shí)，適當(dāng)減少其他抗腫瘤手段，以減少放療、化療等治療方式的不良作用帶給患者的生理與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，KDM4A在口腔鱗癌組織中異常高表達(dá)，其表達(dá)與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。同時(shí)KDM4A表達(dá)陽性患者的預(yù)后較差，提示應(yīng)對患者加強(qiáng)后續(xù)治療以改善患者預(yù)后。因此KDM4A有望成為口腔鱗癌診斷與預(yù)后的腫瘤標(biāo)記物，參與改進(jìn)臨床診療方案。