張潤潤 石玉剛 黃欣瑩 潘 瑩 曾魯瑤 孫錦程 Rammile Ettelaie
(浙江省現(xiàn)代食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心;浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院食品工程系1, 杭州 310035)(利茲大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)學(xué)院2,英國利茲 LS29JT)
L-抗壞血酸棕櫚酸酯(L-ascorbyl palmitate),簡稱L-AP (圖1),是一種重要的抗壞血酸衍生物,脂溶性抗氧化劑,不僅擁有抗壞血酸的抗氧化及防止血管硬化、治療敗血癥的藥理作用,因其分子中的疏水烷基長鏈,增加了其脂溶性,拓寬了它在食品中的應(yīng)用范圍,是一種高效,營養(yǎng),綠色的食品添加劑[1-2]。
圖1 L-AP的分子結(jié)構(gòu)式
目前,常用的抗氧化劑主要有:叔丁基對苯二酚 (TBHQ)、二丁基羥基甲苯 (BHT)、丁基羥基茴香醚 (BHA)、沒食子酸丙酸 (PG)、茶多酚等[3-4]。1980年,“輔致癌作用和腫瘤促進劑的生物效應(yīng)”國際討論會對BHA, BHT和TBHQ評價認為:雖沒有發(fā)現(xiàn)基因毒性和致癌性,但它們是潛在腫瘤促進劑[2]。在日本、歐洲和美國已禁止BHA、BHT和TBHQ在嬰幼兒和兒童食品中使用,提倡用L-AP和生育酚等。它是天然成分抗壞血酸與棕櫚酸酯化后的AA衍生物,對人體無毒害作用,且耐高溫,是我國《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》唯一許可的可用于嬰幼兒食品中的抗氧化劑[2]。由于其自身的功能特性及廣泛的應(yīng)用前景,吸引了眾多學(xué)者們開展了有關(guān)制備及應(yīng)用研究。
該方法主要是將抗壞血酸與棕櫚酸在無機強酸如濃硫酸[5-9]、無水氫氟酸[10]的催化下制得粗品 (圖2a),再經(jīng)精制后而得成品 (表1)??箟难嵩跓釢饬蛩嶂械姆€(wěn)定性較差,為提高產(chǎn)品質(zhì)量,酯化反應(yīng)需控制在較低的溫度下進行。此外,抗壞血酸參與反應(yīng)的方式、催化劑的用量以及棕櫚酸與抗壞血酸的摩爾比也是影響反應(yīng)的重要因素。
Paul等[5]報道稱98%~99%的濃硫酸作為催化劑和反應(yīng)介質(zhì),將過量的脂肪酸溶解于濃硫酸中,克服了傳統(tǒng)工藝中抗壞血酸過量帶來的高成本不足,且脂肪酸的回收復(fù)用更容易實現(xiàn)??箟难崤c棕櫚酸的摩爾比為1∶1.36時,20~25 ℃下反應(yīng)4~16 h,產(chǎn)物產(chǎn)率高達85%。但若采用發(fā)煙硫酸,產(chǎn)率反而下降,這或許表明酯化反應(yīng)的程度與溶劑的含水量有密切關(guān)聯(lián)。Gruetsmacher等[10]以無水氟化氫作為催化劑和溶劑,副反應(yīng)比較少,又避免了過量原料的回收;但無水氟化氫的價格較高,且對設(shè)備的抗腐蝕性能要求更高。上述強酸性環(huán)境中通過直接酯化合成L-AP的方法,反應(yīng)時間長(20~40 h)。曹會蘭等[7]將0.03 mol 抗壞血酸溶于98%濃硫酸中,24 h后再加入棕櫚酸,30 ℃,反應(yīng)2~3 h,該方法不僅收率較高(86%),且反應(yīng)速度加快。Wen等[8]將超聲技術(shù)應(yīng)用于L-AP的合成,反應(yīng)時間縮短至2 h。
圖2 制備L-AP的常見化學(xué)方法
表1 化學(xué)法制備L-抗壞血酸棕櫚酸酯
反應(yīng)物(nAA:nPA)反應(yīng)類型催化劑溶劑溫度/℃反應(yīng)時間/h轉(zhuǎn)化率/%參考文獻1∶1.2~1∶1.36酯化98% H2SO498% H2SO420~304-1885~865-63∶4酯化98% H2SO498% H2SO4302-38671∶:1-1.5∶1酯化、超聲98% H2SO498% H2SO424~50290~9381∶0.75~1.1∶1酯交換95%,99% H2SO495% H2SO420~251673~7510-111∶1.07酰鹵無DMA/DCM01872.512n(AA):n(SOCl2):n(PA)=1.2∶1.3∶1.0酰鹵無DCM25690.2913
直接酯化法目前仍然以濃硫酸為催化劑和反應(yīng)溶劑,存在環(huán)境污染重、反應(yīng)設(shè)備要求高、易發(fā)生副反應(yīng)、產(chǎn)品分離提純困難等諸多缺點。
酯交換法由兩部分組成,中間體棕櫚酸酯的合成以及產(chǎn)物L-AP的合成 (圖2b)。棕櫚酸酯產(chǎn)率越高,雜質(zhì)越少,L-AP的后續(xù)純化過程越方便,產(chǎn)物純度亦越高。雖然酯交換法反應(yīng)路線較直接酯化法長,但提純操作較容易。張衛(wèi)等[10]、龔大春等[11]以棕櫚酸與甲醇酯化制取棕櫚酸甲酯,然后將其加入到溶有抗壞血酸的濃硫酸中,轉(zhuǎn)酯化制備L-AP。由于棕櫚酸甲酯在濃硫酸中的溶解度較大,加快了反應(yīng)速度,節(jié)省了酸用量;且反應(yīng)過程中無水生成,避免了催化劑濃度變化,反應(yīng)時間縮短至18 h,總產(chǎn)率為73%。
棕櫚酰氯法合成工藝由兩部分組成,棕櫚酰氯的制備和抗壞血酸的酯化 (圖2c)。陸豫等[12]先用棕櫚酸與二氯亞砜反應(yīng)制備棕櫚酰氯,然后棕櫚酰氯在二甲基乙酰胺 (DMAC)和二氯甲烷溶劑中,在通氯化氫氣體,0 ℃下與抗壞血酸反應(yīng)18 h,產(chǎn)率84.3%。該法避免了濃硫酸的使用,且反應(yīng)溫度低,副產(chǎn)物少,反應(yīng)純度高,粗產(chǎn)品顏色潔白[4, 10]。該法適用于空間位阻較大或活性較差脂肪酸的酯化反應(yīng)。
化學(xué)法不可避免地存在反應(yīng)條件苛刻,需要特殊的反應(yīng)器,產(chǎn)物分離及提純步驟繁雜等缺點;且化學(xué)合成產(chǎn)品仍存在潛在的食品安全隱患。酶催化法主要是利用脂肪酶作為生物催化劑,催化抗壞血酸與棕櫚酸酯化。酶催化法具有以下優(yōu)點:1) 反應(yīng)條件溫和,不需高溫高壓;2) 催化反應(yīng)特異性高,不易產(chǎn)生副產(chǎn)物;3) 產(chǎn)物品質(zhì)高,環(huán)境污染??;4) 產(chǎn)品后處理簡便、有機溶劑消耗低、生物催化劑易于重復(fù)利用等優(yōu)勢。并且該技術(shù)可滿足消費者們對天然健康抗氧化劑的需求,已經(jīng)成為眾多科研工作者的研究重點領(lǐng)域之一,反應(yīng)過程如圖3所示[14-17]。
圖3 脂肪酶催化合成抗L-AP
表2 生物法制備L-抗壞血酸棕櫚酸酯
生物酶反應(yīng)物(VC:palmitic acid)非水溶劑體系反應(yīng)溫度/℃反應(yīng)時間/h轉(zhuǎn)化率/%參考文獻Powdered lipases from porcine pancreas (PPL), Rhizomucor miehei (RML), Pseudomonas cepacia (PCL), and C. rugose (CRL)1∶2.5hexane37625~5819Bacillus stearothermophilus SB 1 lipase (12.7U/mg)1∶2.5hexane6069719surfactant-coated lipase (from Burkholderia cepacia)1∶6tert- butanol50244720Novozym 435 (from Candida antarctica lipase B)1∶9tert-butanol,Ultrasound 132 W80327.1514Novozym 4351∶9tert-butanol70176715Novozym 435, Lipozyme TL IM, Aspergillus niger lipase, Rhi-zopus chinensis lipase1∶11tert-pentanol/DMSO solventsystem (9∶1, v/v)501864.7416Immobilized Lipase(from Pseudomonas stutzeri)1∶5tert butanol55505717Lipolase 100L1∶2.5DMSO751820 mg/mLYield21Novozym4351∶5tert-amyl alcohol7017122
目前生物法制備L-AP所用酶源,主要集中在脂肪酶。其中Novozym 435,Lipozym TL IM和Lipozyme RM IM 是目前有關(guān)L-AP的理論及實際生產(chǎn)應(yīng)用研究過程中使用較多的商品化固定脂肪酶(表2)。如Lerin等[14-15]考察了不同溶劑中Novozym 435和Lipozyme RM IM催化酯化的反應(yīng)情況,抗壞血酸與棕櫚酸摩爾比為1∶9,Novozym 435濃度為5 wt%,叔丁醇作為反應(yīng)介質(zhì),70 ℃,17 h,最高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為67%。Jiang等[16]結(jié)合統(tǒng)計實驗設(shè)計(Plackett-burman design,Steepest ascent design和Central composite design)與溶劑工程技術(shù)優(yōu)化了Novozym 435和Lipozyme TL IM在叔戊醇與DMSO混合溶劑體系中催化反應(yīng),最適反應(yīng)條件下產(chǎn)物濃度接近20.63 g/L,這也是目前已報道的最高時空產(chǎn)率(3.35 g/L/h)。Santibáez等[17]考察了Novozym 435在70 ℃條件下催化抗壞血酸與棕櫚酸(摩爾比1∶10)的酯化反應(yīng)情況。
近年來,研究者逐漸關(guān)注L-AP的連續(xù)化生產(chǎn)的研究,如Zhao等[18]設(shè)計了一種固定床生物反應(yīng)器 (packed-bed reactor,PBR),反應(yīng)器內(nèi)置了兩根填充柱,一根填充了分子篩,用于除去反應(yīng)過程中副產(chǎn)物水,另一根填充了Novozym 435,作為催化反應(yīng)場所,實現(xiàn)連續(xù)化生物法制備LABEs。
此外,為了克服傳統(tǒng)商品化脂肪酶在實際應(yīng)用中催化效率低的不足,人們還嘗試其他脂肪酶,如固定在疏水性聚丙烯載體Accurel EP 100上的脂肪酶BacillusstearothermophilusSB 1 lipase[19]。利用非離子表面活性劑丙二醇單硬脂酸酯包衣脂肪酶Burkholderiacepacia制備得表面活性劑包衣酶 (圖4)[20]。Santibáez等[18]將Lipase TL固定在疏水性載體上octyl-agarose (TLOA),反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率為57%。Sharma等[21]利用Celite 545 matrix載體固定化脂肪酶Lipolase 100 L,以DMSO為溶劑,75 ℃反應(yīng)18 h,顯著提高了反應(yīng)產(chǎn)率至80%。
圖4 非離子表面活性劑丙二醇單硬脂酸酯包衣脂肪酶
許多綠色化學(xué)概念里認為無溶劑才能排除溶劑的負面影響,無溶劑體系雖然比較簡單又安全,但往往需要至少一個反應(yīng)底物是液體。而當?shù)孜锖痛呋瘎┒际枪腆w,催化劑則很難與底物發(fā)生有效相互作用。因此,溶劑具有許多不可替代的作用。非水介質(zhì)中酶催化反應(yīng)的溶劑主要為有機溶劑、離子液體、超臨界流體等。其中有機溶劑是酶催化合成抗壞血酸脂肪酸酯最常用的反應(yīng)媒介。Bradoo等[20]選用乙腈等有機溶劑作為反應(yīng)的介質(zhì),50 ℃反應(yīng)6 h后。結(jié)果表明,在正己烷 (logP=3.5)中反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高。脂肪酶在具有較高logP值的溶劑中往往可保持催化活性[23]。然而,若酶促反應(yīng)底物分子結(jié)構(gòu)中含有多個羥基基團時,如L-抗壞血酸,將增大體系的logP值,導(dǎo)致脂肪酶在有機溶劑中的溶解度下降。為了克服上述困難,通過選擇一類共溶劑混合體系作為反應(yīng)介質(zhì)[16]。所以,有機溶劑的選取必須同時滿足兩個條件:保持脂肪酶的高活性;有效地增加抗壞血酸的溶解度。
離子液體也是一種近年來發(fā)展研究較多的高效生物催化反應(yīng)介質(zhì),尤其是新型功能離子液體的合成與應(yīng)用研究[24]。許多酶都嘗試用于離子液體中進行催化,如脂肪酶、蛋白酶和氧化還原酶等[25]。其自身具體的獨特物化性質(zhì)包括不揮發(fā),出色的熱穩(wěn)定性,成為極好的替代傳統(tǒng)揮發(fā)性溶劑的選擇。近年來,人們以期利用離子液體作為反應(yīng)溶劑,改善該酶促反應(yīng)的催化效果。如Adamczak等[26]選用6種離子液體作為反應(yīng)介質(zhì),用Candidaantarcticalipase B催化油酸和抗壞血酸反應(yīng)生成抗壞血酸油酸酯,實驗發(fā)現(xiàn),在以[BMIM][BF4]離子液體為介質(zhì)時,反應(yīng)物的轉(zhuǎn)化率最高達到72%。本課題組已有研究結(jié)果表明,我們課題組長期從事功能離子液體的合成與應(yīng)用研究[24-28],通過在咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的陽離子上接枝不同鏈長的醚鏈結(jié)構(gòu),變換陰離子的種類,以期篩選出能有效促進酶促反應(yīng)的新型功能性離子液體EILs (圖5)[24-25,27-29]。這類離子液體中的特殊結(jié)構(gòu),一方面能被用作酶促反應(yīng)強化劑,特異性提高聚合物酶鏈式反應(yīng)的選擇性[29];另一方面,能提高如蔗糖及酚酸等極性有機分子的溶解度,大大提高此類酶促反應(yīng)的產(chǎn)物得率[23]。
圖5 醚型離子液體
微波合成已在化學(xué)合成領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛。微波加速有機反應(yīng)主要用微波的熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)來解釋。微波的熱效應(yīng)表現(xiàn)在其高效加熱特性使反應(yīng)速率加快。微波的非熱效應(yīng)表現(xiàn)在微波起到類似催化劑的作用,調(diào)節(jié)反應(yīng)動力學(xué),降低了反應(yīng)活化能,提高反應(yīng)速率。自1990年以來,微波被應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域特別是在非水相酶催化方面逐漸增多,可以被稱作微波輻射-酶耦合催化(Microwave Irradiation-Enzyme Coupling Catalysis, MIECC)。MIECC不僅可以提高酶催化活性,加快酶催化反應(yīng)速度,還可以提高或改變酶催化反應(yīng)的立體選擇性,提高反應(yīng)的平衡產(chǎn)率。如Gedye等[30]發(fā)現(xiàn)在微波中進行的一氰基酚鹽與苯甲基氯的反應(yīng)要比傳統(tǒng)加熱回流要快240倍。Costa等[22]利用Novozym 435催化反應(yīng),研究了在微波環(huán)境下對生成抗壞血酸棕櫚酸的影響。70 ℃反應(yīng)1 h生成的抗壞血酸棕櫚酸的轉(zhuǎn)化率可高達71%。
此外,適宜強度的超聲波可以加速產(chǎn)酶細胞的新陳代謝過程,提高胞內(nèi)酶的產(chǎn)率,并使酶的構(gòu)象正向轉(zhuǎn)化,提高酶的活性和底物的轉(zhuǎn)化率。同時,超聲波還能促進酶與底物分子之間的相互作用,改善傳質(zhì)效率;增加介質(zhì)中質(zhì)點的振動能量,升高介質(zhì)溫度,提高反應(yīng)速率。如Lindomar[14-15]利用Plackett-Burman design方法,對超聲波輔助下酶促反應(yīng)的主要因素進行了優(yōu)化, 132 W超聲震蕩,70 ℃,僅3 h,反應(yīng)轉(zhuǎn)化率最高為27.15%[14]。
在食品的儲藏與加工過程中發(fā)生的油脂氧化往往會導(dǎo)致食品產(chǎn)品質(zhì)量下降,營養(yǎng)成分流失,貨架期縮短等不利影響。油脂受自然環(huán)境因素影響發(fā)生氧化,會伴隨異味,變色和其他形式的變質(zhì)現(xiàn)象[31]。L-AP是一種有效的油脂氧化自由基阻斷劑[32],亦可用作α-生育酚的協(xié)同作用增效劑 (synergist) (圖6)。豬油及各種植物油的抗氧化過程中,硫辛酸與二氫硫辛酸與L-AP組合使用效果更佳[33]。香菜植物萃取物(1600 mg/kg)與L-AP (500 mg/kg)組合物能有效抑制葵花子油在180 ℃熱處理30 h過程中的氧化進程[34]。Serfert等[35]報道稱使用一種δ構(gòu)型衍生物含量高的抗氧劑生育酚,L-AP和卵磷脂的三元復(fù)合抗氧劑組合,能有效提高富含長鏈多不飽和脂肪酸魚油的氧化穩(wěn)定性。α-生育酚、β-胡蘿卜素與L-AP三元復(fù)合物對黃油三?;视王サ难趸种菩Ч麅?yōu)于其中的二元混合抗氧劑組合[31]。L-AP結(jié)合血紅素鐵和酪蛋白鈣的共噴霧干燥(co-spray-drying)技術(shù),有效抑制了貯藏期內(nèi)棕櫚油的氧化[36]。
圖6 L-AP作為自由基阻斷劑
油脂在高溫煎炸過程中容易發(fā)生氧化、聚合、分解和水解反應(yīng),導(dǎo)致油脂酸價、過氧化值、羰基價等指標升高,并產(chǎn)生對人體有害的物質(zhì)。含有抗壞血酸酯的復(fù)合煎炸油穩(wěn)定劑較其他抗氧化劑具有更強的耐高溫性能,延緩油脂劣變速度。其機理主要通過載體的乳化、包埋,使抗氧化劑在高溫、水解等條件下不易被損耗,并在煎炸過程緩慢釋放,有效抑制高溫油脂的氧化酸敗。
嬰幼兒配方乳粉中一般添加多不飽和脂肪酸(如DHA、EPA、AA)進行調(diào)配脂肪的比例,多不飽和脂肪酸很容易被氧化,在微量金屬如Cu2+和Fe3+的催化作用,容易產(chǎn)生不良氣味的醛類物質(zhì)。若保存期間奶粉發(fā)生以上變化,蛋白質(zhì)、維生素和氨基酸等將受到分解破壞,營養(yǎng)價值降低。其中乳粉中維生素C是最容易被破壞的一類物質(zhì),有氧的存在,它迅速被氧化成脫氫抗壞血酸鹽[37];同時核黃素光化學(xué)破壞后產(chǎn)生的光色素和光黃素可大大加速維生素C的氧化破壞過程。0.05 g/kgL-AP較其他天然抗氧化劑(甾醇、卵磷脂、AA)具有更好的抗氧化功效,能使乳制品的貨架期延長1~2 倍。添加α-生育酚和L-AP可有效減少牛乳因氧化而產(chǎn)生的戊醛與庚醇氣味,但并未對己醛與庚醛的氣味起到抑制效果[38]??寡鮿┑男芡艿狡渥陨順O性與溶解度的影響,而這又直接影響抗氧劑在O/W乳液體系中的實際作用位點。著名的“極性相悖論”(polar paradox theory)指出:極性較強的抗氧劑在非極性體系中的抗氧化能力較強,而非極性抗氧劑在極性體系(如O/W乳液體)中抗氧力較強[39]。Let等[40]研究發(fā)現(xiàn)脂溶性L-AP不僅可完全抑制富含魚油的牛奶乳液的氧化,且能有效避免因使用抗氧化劑生育酚而導(dǎo)致的助氧化副作用 (prooxidant effect)。Zou等[41]考察了α-生育酚,β-胡蘿卜素,L-AP, AA, 檸檬酸, 它們的復(fù)配物,對嬰幼兒配方奶粉乳液的氧化穩(wěn)定性影響。α-生育酚與β-胡蘿卜素的抗氧化效果存在協(xié)同效應(yīng)。
L-AP在油脂中有更大的溶解度,具有更能讓人在感官上接受的氣味。Issa等[42]研究了L-AP對精制棉籽油(CO)、原生橄欖油 (VOO) 化學(xué)的相互酯化(chemical interesterification (CI))的氧化穩(wěn)定性影響,該實驗以脂肪酸組成、PV值(peroxide value)和MAD含量(malonaldehyde contents)作為考察指標,對在60 ℃貯藏28 d后的CO與VOO進行評價,結(jié)果表明,加入L-AP的油脂PV值顯著降低。Anna等[43]在富含魚油的能量棒中添加3種不同的抗氧劑 (咖啡酸、L-AP與γ-生育酚),抑制油脂氧化的效果較佳。
L-AP可以作為面制品改良劑和抗氧化劑。添加了0.38%的L-AP,可縮短面團發(fā)酵的時間,增強面包內(nèi)部蓬松程度和柔軟性,增加面包營養(yǎng)性[35]。另外,L-AP還能抑制面包霉變,延長面包的貨架期。L-AP具有良好的熱穩(wěn)定性,將其加入面包中,能夠促使面包中鐵離子的吸收。當面包中的L-AP與Fe的摩爾比為4∶1時,F(xiàn)e的吸收率分別達20.2%[44]。添加L-AP與血紅素鐵和酪蛋白鈣的共噴霧干燥技術(shù)(co-spray-drying)對血紅素鐵強化的烘焙食品(巧克力夾心餅干)的氧化穩(wěn)定性有顯著提升作用,產(chǎn)品的貨架期可延長至1 年[45]。將L-AP加入鹵肉制品中,具有一定的抗菌作用,提高了鹵肉制品的食用安全性[46]。
血液中過氧化脂質(zhì)的升高,比膽固醇的升高對動脈粥樣硬化的形成危害更大。由于L-AP獨特的脂溶性,在保健食品方面主要用作人體抗氧化劑和營養(yǎng)強化劑。L-AP還能阻止亞硝胺的產(chǎn)生,可預(yù)防癌癥,對于預(yù)防心腦血管病和抗衰老有較好的效果,是一種很好的營養(yǎng)強化劑。Kageyama等[47]研究發(fā)現(xiàn),L-AP能強烈地抑制Ehrlich ascites癌細胞的DNA合成,分解癌細胞細胞膜的磷脂,是良好的抗癌物質(zhì)。Janesirisakule等[48]通過在姜黃素分子結(jié)構(gòu)上嫁接聚乙烯醇鏈而制備出一種新的納米載體[CUR-PV(OH)],該載體表現(xiàn)出良好的自由基清除效果,利用該納米載體對L-AP進行微膠囊化,更有利于L-AP通過毛囊通道滲透入豬皮的真皮層內(nèi)部。
隨著人們對于生活健康品質(zhì)的追求日趨重視,對食品中的抗氧化劑要求越來越高,這就需要更高質(zhì)量的抗氧化劑來滿足人們的需求,這也就對制備方法及生產(chǎn)工藝提出更大的挑戰(zhàn),以期實現(xiàn)目標產(chǎn)品的純度更高,產(chǎn)量更高。這些都激勵研究者們努力進一步探尋更有效的制備方法(化學(xué)或生物轉(zhuǎn)化等),摸索更優(yōu)化的生產(chǎn)工藝條件(工藝參數(shù)、過程模擬等),生產(chǎn)出更多更好的抗壞血酸棕櫚酸酯產(chǎn)品。