王 強(qiáng) 王仲明 謝躍杰 李園園 王 波 盧賜強(qiáng) 趙富昌 黃梅桂

(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院1，重慶 400067) (重慶第二師范學(xué)院脂質(zhì)資源與兒童日化品協(xié)同創(chuàng)新中心2，重慶 400067) (甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心3，蘭州 737100) (重慶江源油橄欖開發(fā)有限公司4，重慶 401587) (南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院5，南京 210037)

橄欖苦苷(oleuropein，OE)及其苷元(aglycon)是一種天然裂環(huán)烯醚萜苷類多酚化合物，廣泛存在于各種木犀科的木犀欖屬、丁香屬、女貞屬等植物中。20世紀(jì)50年代初，OE一直被認(rèn)為是橄欖油中的一種苦味素；1960年，Panizzi等[1]首次從橄欖油中苦味成分中分離出OE；1970年，Inouye等[2]首次從女貞樹提取并純化了橄欖苦苷，并明確了OE結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)中含有6個羥基(如圖1所示)，具有多種藥理活性，近年來研究備受關(guān)注。

圖1 基本結(jié)構(gòu)式

研發(fā)發(fā)現(xiàn)，橄欖苦苷以油橄欖及其葉中含量最高[3-5]。油橄欖(OleaeuropaeaL.)屬木犀科(Oleaceae)

木犀欖屬(Olea)常綠喬木，是世界著名的木本油料兼果用樹種，栽培品種有較高食用價(jià)值。采用油橄欖提取橄欖苦苷及其苷元成本太高[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)油橄欖葉含有的抗氧化活性成分較之橄欖油更為突出，主要有橄欖苦苷、羥基酪醇(hydroxytyrosol，HT)、黃酮類、木酚素類和咖啡酰苯乙醇苷類等多酚類化合物[3-7]；油橄欖葉提取物早已被地中海地區(qū)的人們當(dāng)作民間醫(yī)藥來治療發(fā)燒和其他疾病如瘧疾等[8]，油橄欖葉提取物具有強(qiáng)的抗氧化活性和抑菌活性[9]。研究表明，油橄欖葉中含有豐富的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗腫瘤和降血糖等活性，并逐漸應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品、化妝品等行業(yè)且應(yīng)用前景廣闊[8-12]。

我國甘肅隴南、重慶奉節(jié)、四川廣元等地均大力推廣油橄欖種植，在油橄欖果生長過程中，會產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——油橄欖葉，每年每棵油橄欖樹修剪過程就要產(chǎn)生超過25 kg的嫩枝和樹葉。雖然國外已有將油橄欖葉提取物用于食品、藥品和化妝品等行業(yè)的報(bào)道，國內(nèi)也有一些將橄欖葉加工成茶飲料、油橄欖葉掛面等報(bào)道，但均直接利用原料葉或粗提物；對如何有效提取分離油橄欖葉中裂環(huán)烯醚萜類化合物，拓展該類化合物的應(yīng)用范圍，還有待進(jìn)一步研究。油橄欖葉中橄欖苦苷的提取方法通常有酶提取法、醇浸提法、索氏抽提法、微波輔助提取法、超臨界CO2萃取法等，但是均對油橄欖葉提取物中橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物的組成未知[13-18]。本實(shí)驗(yàn)通過在橄欖苦苷提取的過程中添加各種水解酶，探索水解酶對提取過程及其水解產(chǎn)物的影響機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，分析油橄欖葉提取物中橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物的組成和抗氧化能力，以期對油橄欖葉有效綜合利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試油橄欖葉：從重慶奉節(jié)縣油橄欖種植基地采集(實(shí)驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取不同株生長健壯、長勢一致的生葉為試材，均為成熟葉，即非嫩葉或老葉)；

橄欖苦苷、羥基洛醇對照品(純度≥98%)：成都曼思特生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、維生素C(VC)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚

(BHT)、β-葡萄糖苷酶(A. niger)(100 U/mg)、β-葡萄糖苷酶(來自杏仁)(100 U/mg)：美國Sigma-Aldrich公司；半纖維素酶(A. niger)(1.5 U/mg)： 北京索萊寶科技有限公司；木瓜蛋白酶(100U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、中性蛋白酶(100U/mg)：諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；纖維素酶(45 U/mg)： 阿拉丁試劑(上海)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

JYL-C012Joyoung/九陽料理機(jī)；高壓均質(zhì)機(jī)；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽、722S 型可見分光光度計(jì)；PHS-3C型pH計(jì)；KH-5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油橄欖葉處理方法

蒸餾水清洗，室內(nèi)自然陰干，60 ℃干燥，粉碎過40目篩，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 油橄欖葉中橄欖苦苷的提取

定量稱取1.0 g油橄欖葉干燥粉末，加入40 mL甲醇水溶液(甲醇與水的比例為4∶1，V/V)，攪拌群均勻后，置于超聲波清洗器中超聲提取24 h；冷卻至室溫，離心(1 500×g，15 min)，取上清液，過0.45 μm濾膜，計(jì)算油橄欖葉中橄欖苦苷提取率[15]。

1.2.3 酶法水解

選取木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶(A. niger)、β-葡萄糖苷酶(來自杏仁)、半纖維素酶(A. niger)、纖維素酶7種酶，稱取相同酶活力(1.5 U/mg)的各種酶均在最適溫度和pH條件下進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)(即將酶分別加入“1.2.2”實(shí)驗(yàn)過程中)。分別于1、2、4、6、8、10、12 h將酶解體系放置于-20℃條件下終止酶解反應(yīng)，分析各酶解階段的酶解率及產(chǎn)物組成。

酶解率=(m橄欖苦苷水解前-m橄欖苦苷水解后)÷m橄欖苦苷水解前×100%

1.2.4 LC-MS/MS產(chǎn)物組成分析

色譜條件：色譜柱為UPLC BEH C18(50 mm × 1.0 mm, 1.7 μm)；流動相：A為0.2%(V/V)甲酸乙腈， B為0.2%甲酸水；流速0.15 mL/min；進(jìn)樣量：2.0 μL；柱溫35 ℃。質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，在負(fù)離子電離模式下選用MRM掃描方式進(jìn)行質(zhì)譜測定；毛細(xì)管電壓4 kV，噴霧壓力5 kV，輔助加熱氣：氮?dú)?，流?8 L/min；加熱溫度：300 ℃；其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 LC-MS/MS分析橄欖苦苷水解產(chǎn)物的定性和定量參數(shù)

1.2.5 油橄欖葉提取物水解前后的抗氧化能力的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)測定

1.2.5.1 鐵離子還原法(FRAP) 參考Iris等[20]報(bào)道的方法。取100 μL提取物，加1.8 mL TPTZ工作液[由0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液25 mL(pH 3.6)，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL組成]，混勻后37 ℃反應(yīng)15 min，測定吸光度A593 nm，以1.0 mmol/L FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品抗氧化活性以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

1.2.5.2 清除DPPH自由基(DPPH·)的測定 參考Liu等[21]方法進(jìn)行，將4 mL的95%DPPH·乙醇溶液(10-4mol·L-1)與提取物500 μL混勻后測定吸光度A517 nm，采用IC50評價(jià)橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物抗氧化能力大小。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±SD表示(n=3)，用Duncan進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)，Origin 8.0軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-MS/MS測定橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物

LC-MS/MS測定油橄欖葉提取物水解液中橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物(橄欖苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄欖苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羥基酪醇)的總離子流圖如圖2所示，其線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)參數(shù)如表2所示。初始提取物(即未加水解酶)中各目標(biāo)物含量如表2所示。由此可見，各成分在所述線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2≥0.999)，本方法簡單、快速、靈敏，適用于橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物的定性和定量分析。

注：1～6分別表示橄欖苦苷、橄欖苦苷元Oleuropein aglycon、烙醇苷元Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄欖苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羥基酪醇。
圖2 LC-MS/MS測定油橄欖葉提取物水解液中橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物的總離子流色譜圖

表2 定量分析橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物的的線性范圍、回歸方程和相關(guān)系數(shù)參數(shù)

2.2 酶種類的篩選

分別采用木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶(來自A. niger)、β-葡萄糖苷酶(來自杏仁)、半纖維素酶(A. niger)、纖維素酶7種酶進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，分析了不同酶對油橄欖葉提取物中橄欖苦苷水解程度的影響，結(jié)果如圖3所示。7種酶對油橄欖葉提取物中橄欖苦苷的水解效果順序?yàn)椋害?葡萄糖苷酶(A. niger)>β-葡萄糖苷酶(來自杏仁)>半纖維素酶(A. niger)>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>纖維素酶>堿性蛋白酶。本研究發(fā)現(xiàn)，各種水解酶在醇提過程中可以不同程度提高橄欖苦苷的水解率，其原理在于各種水解酶作用于原料分子中，促進(jìn)原料中的橄欖苦苷的釋放；其中以β-葡萄糖苷酶的酶促水解效果最佳。木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等蛋白酶均主要作用于蛋白質(zhì)或肽，文獻(xiàn)報(bào)道這些蛋白酶能使植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，釋放活性成分[15,19]，而本研究發(fā)現(xiàn)這種效果較弱。

圖3 非酶處理與不同種酶處理對橄欖苦苷水解率的影響

2.3 β-葡萄糖苷酶(A.niger)處理對橄欖苦苷水解產(chǎn)物的影響

重點(diǎn)分析了β-葡萄糖苷酶(A.niger)處理對油橄欖葉提取物中橄欖苦苷水解產(chǎn)物的影響，如圖4所示。隨著水解時間的延長，油橄欖葉提取物水解液中橄欖苦苷的含量持續(xù)下降，其中0～4 h時間段橄欖苦苷含量迅速下降，該時間段油橄欖葉提取物水解液中橄欖苦苷元濃度迅速上升，4 h后趨于平衡；而隨著油橄欖葉提取物水解液中橄欖苦苷的含量迅速下降(0～4 h時間段)，水解產(chǎn)物烙醇苷元、去(羧基甲基)橄欖苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元和羥基酪醇等濃度顯示出不同程度的增加(如圖4所示)。油橄欖葉提取物經(jīng)過酶法輔助提取和水解處理后，其橄欖苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄欖苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羥基酪醇含量分別為：5.35、0.12、0.28、0.02、0.76 μg/mL；與初始提取物(即未加水解酶)中目標(biāo)物含量相比(如表2所示)，酶法輔助提取和水解處理可以顯著提高產(chǎn)品中功效成分的含量。油橄欖葉提取物酶解工藝與傳統(tǒng)的酸解、堿解工藝相比，酶解方法條件較溫和，整個過程減少了酸、堿催化劑的使用，是一種可以進(jìn)一步開發(fā)利用的水解方式[22-23]。

圖4 β-葡萄糖苷酶(A. niger)處理對橄欖苦苷水解產(chǎn)物的影響

2.4油橄欖葉提取物水解前后的抗氧化能力比較分析

評價(jià)提取物及其水解產(chǎn)物體外抗氧化能力，常選擇自由基清除率達(dá)到50%時測試對象的濃度作為評價(jià)指標(biāo)，即半數(shù)抑制濃度IC50。IC50值越小，表示抗氧化劑清除自由基的能力越強(qiáng)，反之，IC50值越大，表示抗氧化劑清除自由基的能力越弱。

采用三價(jià)鐵離子還原法、DPPH·體系對油橄欖葉提取物(即未加水解酶)及其水解產(chǎn)物(即添加β-葡萄糖苷酶(A. niger)后的穩(wěn)定水解產(chǎn)物)抗氧化活性進(jìn)行研究，以VC、BHT、橄欖苦苷、羥基酪醇為對照。如圖5所示，在FRAP法中，羥基酪醇還原Fe～(3+)的能力最強(qiáng)(IC50=4.3 μg/mL)，還原Fe～(3+)的能力順序?yàn)椋毫u基酪醇>油橄欖葉提取物水解液(A. niger)>橄欖苦苷>VC>BHT>油橄欖葉提取物(未加水解酶)；其中油橄欖葉提取物水解液(A. niger)還原Fe～(3+)的能力與羥基酪醇較為接近。油橄欖葉提取物水解液(A. niger)的還原能力要大于VC(2.12倍)和BHT(5.95倍)，油橄欖葉提取物水解液(A. niger)的清除DPPH·的能力要大于VC(1.29倍)和BHT(3.38倍)。此外，當(dāng)油橄欖葉提取物及其水解產(chǎn)物和對照品對DPPH·的清除率達(dá)到50%，羥基酪醇濃度最小，油橄欖葉提取物水解液(A. niger)的濃度次之，油橄欖葉提取物水解液(A. niger)的濃度最大。油橄欖提取物[即添加β-葡萄糖苷酶(A. niger)]的抗氧化能力弱于羥基酪醇而強(qiáng)于橄欖苦苷，其可能原因在于所提取的提取液中均含有該兩種成分及其水解產(chǎn)品，各成分之間存在協(xié)同抗氧化作用。

注：橫坐標(biāo)數(shù)字1～4分別表示樣品油橄欖葉提取物(水解前)、油橄欖葉提取物(水解后)、橄欖苦苷(標(biāo)準(zhǔn)品)、羥基酪醇(標(biāo)準(zhǔn)品)；不同小寫字和大寫字母分別表示組間差異顯著，P<0.05。
圖5 油橄欖葉提取物、橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物抗氧化能力的數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)

3 結(jié)論

3.1 建立了油橄欖葉提取物水解液中橄欖苦苷及其水解產(chǎn)物烙醇苷元Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄欖苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元和羥基酪醇的定量分析方法。

3.2 七種酶對油橄欖葉提取物中橄欖苦苷的水解效果順序?yàn)椋害?葡萄糖苷酶(來自A. niger)>β-葡萄糖苷酶(來自杏仁)>半纖維素酶(A. niger)>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>纖維素酶>堿性蛋白酶。

3.3 采用β-葡萄糖苷酶(來自A. niger)處理油橄欖葉提取物，因其高效的抗氧化活性使其更適合應(yīng)用于食品、化妝品和藥品等領(lǐng)域，具有廣闊的市場空間，因此酶降解油橄欖葉提取物具有顯著的市場應(yīng)用價(jià)值。