馬春娟，單柏宇，路 芳，徐 陽

(1.長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林長春 130031；2.白城市食品藥品監(jiān)督管理所，吉林白城 137000)

螞蟻作為保健品被人類所食用具有悠久的歷史，對治療人類疾病方面具有重要作用。全世界有15000種螞蟻，我國約有2000種，其中具有食用和藥用價值的約有10種，例如擬黑多刺蟻、雙突多刺蟻、黃猄蟻、大黑蟻、巨頭切葉蟻、日本弓背蟻、鋪道蟻等[1-4]。國內(nèi)外文獻資料表明，可食用螞蟻營養(yǎng)價值高，并具有多種保健和治療疾病的功能，堪稱“微型動物營養(yǎng)寶庫”和“天然藥物加工廠”[5-6],例如抗病毒、抗炎、增強免疫、清除乙肝病毒的功能[7]，對腎虛、頭昏耳鳴、失眠多夢、陽痿遺精、風濕痹痛、中風偏癱、手足麻木、紅斑性狼瘡、硬皮病、皮肌炎、癰腫疔瘡、毒蛇咬傷有一定療效，尤其是在抗疲勞方面尤為突出[8-10]。

膽固醇又稱膽甾醇，是一種環(huán)戊烷多氫菲的衍生物。膽固醇具有重要的藥理作用，對維持人體正常的生理功能具有重要作用[11-13]。膽固醇是激素類物質合成的原料，可經(jīng)代謝轉化為類固醇激素，類固醇激素對抗疲勞方面具有重要作用，故膽固醇的含量對螞蟻抗疲勞活性具有重要影響[14]。過高地攝入膽固醇可形成高脂血癥，引起動脈粥樣硬化，進而誘發(fā)冠心病、高血壓等一系列心腦血管疾病[15-17]。因此，適度控制外源性膽固醇攝入是預防動脈粥樣硬化及心腦血管疾病的重要措施，故測定螞蟻中膽固醇的含量可以指導特定人群對螞蟻及其提取物的食用量[18-19]。

目前，國內(nèi)文獻尚沒有關于HPLC法測定螞蟻中膽固醇含量的相關報道。因此，建立一種快速、高效的膽固醇含量的測定方法是非常必要的。本文利用HPLC法檢測螞蟻中膽固醇的含量，方法精密度高，快捷、有效，為螞蟻的鑒別、質量控制和食用指導奠定研究基礎。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試藥

電子天平(AVW20D型，日本島津制作所)；超聲波清洗器(KQ-400KDE型，昆山市超聲儀器有限公司)；液相色譜儀(Aglient 1260型，美國安捷倫有限公司)。

水為娃哈哈純凈水；膽固醇標準品(含量≥98%，批號：111618-200301)；甲醇為色譜純，二氯甲烷為分析級試劑。螞蟻(經(jīng)長春中醫(yī)藥大學生藥教研室李波老師鑒定為螞蟻，產(chǎn)地見表1)

1.2 對照品的配制

精密稱取膽固醇標準品約5.0mg，置100mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，甲醇定容至刻度，即濃度為0.05mg/mL膽固醇對照品溶液。

1.3 供試品溶液的配制

取適量螞蟻放置于105℃鼓風干燥箱中干燥約7～8h至恒重，冷卻研磨至粉末。精密稱取螞蟻粉末約10g，加200mL的二氯甲烷超聲提取約15min，同法提取3次，合并濾液，回收溶劑，用適量甲醇溶解，至10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即供試品溶液。

2 結果與分析

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應性實驗

色譜柱為Agilent TC-C18(250mm×4.6mm，5μm),流動相為甲醇∶水(V/V,98∶2)，流速為1mL/min，檢測波長為205nm，柱溫為30℃，進樣量為10μL。理論塔板數(shù)按照膽固醇計算均不小于3000，在此條件下，膽固醇與其它物質分離度大于1.5，符合藥典要求，色譜圖見圖1、圖2。

2.2 線性關系考察

精密稱取膽固醇對照品10.51mg，置于10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得濃度為1.05mg/mL的膽固醇母液。精密吸取膽固醇母液2mL、1mL、0.5mL、0.3mL、0.1mL、0.1mL，置于10mL、10mL、10mL、10mL、10mL、25mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，即濃度為0.2102mg/mL、0.1051mg/mL、0.0525mg/mL、0.0315mg/mL、0.0105mg/mL和0.0042mg/mL溶液。按照2.1中色譜條件分別將溶液注入高效液相色譜儀，記錄色譜峰面積。以色譜峰面積(Y)對溶液濃度(X)作圖，得到膽固醇的回歸方程為Y=6.3845X-5.3825，r=0.9996(n=6)，表明膽固醇濃度在0.0042～0.2102mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3 精密度試驗

分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液(20170301)各10μL，按照2.1中色譜條件重復注入高效液相色譜儀6次，測得膽固醇色譜峰面積的RSD值分別為1.02%和1.91%，結果表明此方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

將供試品溶液(20170301)，分別在0，2，4，6，8，10，12h時，依次進樣，測得膽固醇色譜峰面積的RSD值為1.68%(n=7)，結果表明供試品溶液中膽固醇在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復性實驗

按照1.3中供試品配制方法，分別配制6份螞蟻(20170301)供試品溶液，依法進行含量測定，并計算出其含量的RSD值為1.87%，結果表明此方法重復性良好。

2.6 加樣回收率實驗

精密稱取膽固醇標準品5.05mg，定容至10mL，吸取1mL，分別加入6份約5g的螞蟻樣品(20170301)中，按照1.3中供試品配制方法進行配制，得6份加樣回收率供試品，進入高效液相，測定含量，計算回收率。結果膽固醇的平均回收率為99.12%，RSD值為1.77%(n=6)，表明此方法回收率良好。

2.7 樣品測定

取品種不同產(chǎn)地的螞蟻樣品，按照制備供試品方法制備，分別精密吸取對照品和供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀中，進行含量測定，記錄色譜峰面積，并按照外標法計算供試品溶液中膽固醇的含量，結果見表1。

表1 不同產(chǎn)地螞蟻中膽固醇的含量

3 討論

對比浸漬法、超聲提取法和熱回流提取法，結果發(fā)現(xiàn)超聲提取法和熱回流提取法提取效率較高，但是由于熱回流提取法提取時間較長，且操作復雜，故最終確定超聲提取法。

對比甲醇-水，乙腈-水，甲醇-磷酸-水，乙腈-磷酸-水的色譜條件，最終確定甲醇-水為最佳的流動相。由于膽固醇的極性較小，水相比例的增大，雖然可以提高膽固醇的分離效果，但對出峰時間影響較大，同時考慮分離效果和測定效率，最終確定甲醇-水(V/V，98∶2)。

對比不同波長對樣品含量測定的影響，發(fā)現(xiàn)膽固醇在較低波長下具有良好的吸收，但由于吸收波長較低，基線的波動較大，且影響膽固醇供試品中膽固醇的分離，故最終選取波長為205nm。

膽固醇具有多方面的藥效作用，是螞蟻中重要的甾體類成分，不僅可以直接影響螞蟻抗疲勞方面的藥效作用，且對于其它甾體類成分的合成具有重要影響，故本文建立一種可以快速和準確測定螞蟻中膽固醇的方法，為螞蟻的質量控制奠定研究基礎。本文對東北地區(qū)擬黑多刺蟻和紅螞蟻中膽固醇的含量進行測定，并進行對比，發(fā)現(xiàn)同品種，不同產(chǎn)地的擬黑多刺蟻和紅螞蟻膽固醇的含量差異很大，紅螞蟻中膽固醇的含量要普遍高于擬黑多刺蟻中的含量。