張青嫻 ，徐引弟 ，王治方 ，朱文豪 ，焦文強(qiáng) ，李海利 ，方劍玉 ，郎利敏 ，張立憲 ，游 一 ，許 峰 ，鄭萬錄 ，王克領(lǐng)

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002）

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是引起多種哺乳動(dòng)物呼吸道隱性感染及急、慢性呼吸道炎癥的病原菌，為嚴(yán)格寄生菌，豬、羊、馬、牛、鼠、兔、狗、貓等多種動(dòng)物都可感染該病，還可感染雪貂、刺猬、狐等野生動(dòng)物，甚至可以感染人。Bb可引發(fā)豬萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR），是豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要病原菌之一[1]。Bb 的先期感染可使機(jī)體免疫力下降，更容易繼發(fā)感染其他多種病原，從而增加豬群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。

為了解河南省豬Bb的流行病學(xué)情況，采集近年來河南省發(fā)生呼吸道疾病的規(guī)模化豬場病料組織，對Bb進(jìn)行分離鑒定，分析其流行概況，為客觀評(píng)估河南省豬Bb的危害提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來源 對2015—2017年河南省各地市的規(guī)模化豬場發(fā)生明顯萎縮性鼻炎癥狀的豬采集鼻拭子樣品，有肺炎癥狀的豬無菌采集肺組織，部分瀕臨死亡的病豬采集氣管、心血和關(guān)節(jié)液等組織，共采集到1 022份樣品。對于采集到的樣品，立即進(jìn)行Bb的分離鑒定。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptic soy broth，TSB）購自Difco公司。麥康凱（MC）瓊脂、鮑-姜氏培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂、NAD（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）革蘭氏染色液、生化管、新鮮羊血等試劑購自上海生工生物工程有限公司。藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。Taq PCR master mix，DL2000 DNA Marker等 PCR 試劑購自寶生物（大連）有限公司。

1.2 Bb的染色鏡檢

將經(jīng)無菌采集的病料劃線接種于TSA平皿，置于37℃培養(yǎng)24～48 h后，挑取半透明、光滑且直徑1～2 mm的菌落進(jìn)行革蘭氏染色。染色結(jié)果顯示，Bb為紅色的陰性小桿菌或球桿菌，呈現(xiàn)較典型的兩極濃染，挑取可疑菌落傳代純化后進(jìn)行生化及PCR鑒定。

1.3 生化鑒定

按使用說明進(jìn)行以下生化試驗(yàn)：氧化/發(fā)酵（O/F）管、乳糖、葡萄糖、MR、吲哚、VP、西蒙氏枸櫞酸鈉、硝酸鹽還原、硫化氫、觸酶、尿素和氧化酶，并接種于綿羊血鮑-姜氏培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基。

1.4 Bb的PCR鑒定

參考GenBank上的flaA基因序列（序列號(hào)AF232939）設(shè)計(jì) 1 對引物：F1：5′-TGGCGCCTGCCC TATC-3′，F(xiàn)2：5′-AGGCTCCCAAGAGAGAAA-3′，擴(kuò)增目的片段大小為237 bp，由寶生物大連分公司合成。

取40 μL無菌水置于1.5 mL離心管中，挑取單菌落懸浮混勻后，100℃水浴5～10 min，迅速冰浴5 min，置于高速離心機(jī)中4℃10 000 r/min離心2 min，取上清作為PCR模板。

配制 25 μL PCR 反應(yīng)體系：10×Taq Mix Buffer 13 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 1.0 μL，無菌水19μL，模板1μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃變性5min；94℃ 30 s，54℃30 s，72℃ 40 s，進(jìn)行 30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物于4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠100 V電壓下電泳45 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.5 Bb的共感染菌情況調(diào)查

將發(fā)病豬病料無菌接種于含胎牛血清和NAD的TSA培養(yǎng)基中，分離出可疑菌落，純化傳代后進(jìn)行PCR鑒定。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)4對引物（表1），對鏈球菌（Streptococcus，S.suis）、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）、大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）和巴氏桿菌（Pasteurella multicida，Pm）的菌株，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定菌株種類。

表1 Bb的共感染細(xì)菌所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 Bb的生長培養(yǎng)特性和生化試驗(yàn)

Bb在含血清的TSA平皿上生長成黃白色、圓形、光滑、直徑約1 mm的小菌落（圖1）。分離菌株在10%綿羊血鮑-姜氏培養(yǎng)基上生長呈珍珠狀，周邊有邊界不清楚的明顯β-溶血環(huán)，這說明分離菌株都是Bb I相菌（圖2）。在1 000倍顯微鏡下，Bb顯示為革蘭氏陰性小桿菌或球桿菌，菌體形態(tài)一致，有兩極著色趨向（圖3）。

Bb的生化特征為糖發(fā)酵管上有菌膜形成，不發(fā)酵任何糖類，西蒙氏枸櫞酸鈉試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性，觸酶和氧化酶陽性，尿素陽性，不產(chǎn)生靛基質(zhì)，MR和VP陰性。

2.2 Bb的PCR鑒定結(jié)果

由圖4可知，分離菌株經(jīng)支氣管敗血波氏桿菌flaA基因PCR鑒定后，在237 bp處呈現(xiàn)陽性條帶者定為Bb檢測陽性。

2.3 Bb的細(xì)菌共感染結(jié)果

圖5為鑒定4種常見共感染細(xì)菌的PCR結(jié)果，結(jié)果表明，陽性結(jié)果與預(yù)期設(shè)想一致。1 022份組織病料中，一共分離出波氏桿菌82株，總分離率只有8.0%，其中，有30份組織病料只分離出波氏桿菌，52 份共感染病料以 S.suis，HPS，E.coli，Pm居多，且鼻拭子分離率低于肺臟組織。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從河南省各地市規(guī)?；i場采集呼吸道病豬的鼻拭子和肺臟、關(guān)節(jié)等組織樣品，樣品數(shù)量和來源在一定程度上代表了河南省Bb的組織分離特點(diǎn)和實(shí)際感染情況。但由于呼吸道與外界接觸廣泛，容易滋生大量雜菌，且Bb生長慢于許多存在于上呼吸道中的其他細(xì)菌，再加上臨床大量用藥，導(dǎo)致Bb分離率較低[8-10]。Bb是呼吸道的常在菌，本試驗(yàn)分離時(shí)不僅能從肺臟、氣管、鼻拭子等呼吸系統(tǒng)組織中分離到，還可以從部分病豬的關(guān)節(jié)、心血分離到該菌，說明Bb可以從呼吸系統(tǒng)進(jìn)入血液循環(huán)，造成全身感染。

一般情況下，Bb毒力較弱，人工感染試驗(yàn)證實(shí)，毒力很強(qiáng)的Bb也不能引起明顯的或進(jìn)行性鼻甲萎縮或鼻盤變形[11-14]。目前研究認(rèn)為，單一的Bb感染并不能導(dǎo)致豬群嚴(yán)重發(fā)病，而如果豬群中已感染 Bb，可促進(jìn)其他多種病原（如 E.coli，HPS，S.suis，豬繁殖與呼吸障礙綜合征、豬流感病毒等）的繼發(fā)感染，造成的損失嚴(yán)重[15-18]。

本研究中Bb與豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌和豬大腸桿菌共感染的比例較高，是否在一定程度上促進(jìn)S.suis，HPS和E.coli在河南省的流行，有待進(jìn)一步的研究[19-20]。因本試驗(yàn)在細(xì)菌分離的同時(shí)，未進(jìn)行病毒學(xué)相關(guān)檢測，故不排除存在PRRSV，SIV等病毒共同感染的可能。