張 敏，郜春花，李建華，盧晉晶，靳東升，郜雅靜

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西 太原 030031）

土壤作為生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)，它養(yǎng)育著地球上一代又一代的人類，但目前面臨著各種威脅，其中，土壤污染最嚴(yán)重，土壤污染破壞生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定，影響人類健康，是危害全球環(huán)境質(zhì)量的重要問(wèn)題之一，是人類目前必須重視并解決的問(wèn)題。山西省作為我國(guó)重要的工業(yè)基地，因采礦和工業(yè)制造導(dǎo)致的土壤重金屬污染問(wèn)題十分嚴(yán)重，其中鉛污染尤為突出[1-3]。鉛作為一種有毒重金屬，土壤中過(guò)量的鉛積累會(huì)改變土壤性質(zhì)，導(dǎo)致土壤養(yǎng)分元素供應(yīng)減少、肥力降低、土壤微生物的多樣性減少[4-6]，還可進(jìn)入作物體內(nèi)，阻礙作物生長(zhǎng)發(fā)育，降低作物的品質(zhì)，并通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害[7-8]。

目前，土壤重金屬污染的修復(fù)研究是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[9-13]，與以往重金屬污染治理的物理、化學(xué)修復(fù)相比較，生物修復(fù)費(fèi)用低、效果好，不會(huì)或很少造成二次污染[14]，其中，微生物修復(fù)已成為當(dāng)今環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，而微生物-植物聯(lián)合修復(fù)更是具有挑戰(zhàn)性的研究方向之一[15]。微生物修復(fù)或微生物-植物聯(lián)合修復(fù)的首要任務(wù)就是獲得新的具有極高耐受性和吸附效果的微生物菌株。細(xì)菌作為微生物中的最大群體，在微生物修復(fù)領(lǐng)域占主要地位，目前研究主要集中在細(xì)菌對(duì)重金屬的吸附性、耐受性以及作用機(jī)制等方面[16]。但是，由于微生物的地域性與多樣性，同一地域、不同種類微生物或不同地域、同一種類微生物的生長(zhǎng)條件、內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異較大，與重金屬相互作用過(guò)程相當(dāng)復(fù)雜，作用機(jī)理的研究還不夠清晰，未形成統(tǒng)一的理論與標(biāo)準(zhǔn)[17-18]。因此，微生物吸附特性與機(jī)制的研究具有極大的科研價(jià)值。

本試驗(yàn)以前期篩選出的耐鉛菌株GDYX03（Enterobacter ludwigii）為研究對(duì)象，尋求其最佳吸附條件，構(gòu)建吸附動(dòng)力學(xué)與吸附等溫模型對(duì)其吸附行為進(jìn)行分析，利用透射電鏡與紅外光譜儀對(duì)菌株吸附的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行初步研究，探討菌株對(duì)重金屬鉛的吸附機(jī)制，為后期重金屬鉛污染生物修復(fù)的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種來(lái)源

菌株GDYX03篩選于太原市小店區(qū)疙瘩營(yíng)（污水處理廠）土壤，經(jīng)鑒定為腸桿菌屬（Enterobacter ludwigii）。

1.2 吸附特性與機(jī)制研究

1.2.1 不同條件對(duì)菌株吸附Pb2+能力的影響

1.2.1.1 菌體的制備 將耐鉛菌株GDYX03在土豆葡萄糖液體培養(yǎng)基的優(yōu)化生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)至最佳吸附狀態(tài)，4 000 r/min離心20 min，用去離子水清洗菌體，繼續(xù)離心，反復(fù)3次，收集菌體活細(xì)胞。

1.2.1.2 吸附試驗(yàn) 將收集到的菌體活細(xì)胞制成定量菌懸液，取適量于20 mL含Pb2+水溶液的小三角瓶（50 mL）中，在設(shè)置的各參數(shù)下吸附后，17 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)定Pb2+的濃度，每個(gè)試驗(yàn)做3個(gè)重復(fù)，每組均以不加菌體組為對(duì)照。

1.2.1.3 Pb2+濃度的測(cè)定 采用原子分光光度計(jì)測(cè)定Pb2+的濃度，計(jì)算公式如下。

1.2.1.4 活細(xì)胞吸附方式的選擇 按10%的接菌量將培養(yǎng)24 h的種子液接種于含Pb2+質(zhì)量濃度為100 mg/L的液體培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min培養(yǎng)于恒溫?fù)u床中，以不接菌、含Pb2+質(zhì)量濃度為100 mg/L的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)量生長(zhǎng)菌株過(guò)程吸附的吸附效果，并與無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的菌體活細(xì)胞吸附效果進(jìn)行比較。

1.2.1.5 不同條件下耐鉛菌株對(duì)Pb2+吸附能力的研究 以菌齡（菌株培養(yǎng)時(shí)間）、溶液pH值、接菌量、吸附溫度、吸附時(shí)間和初始鉛質(zhì)量濃度為單因素，檢測(cè)菌體在各種條件下對(duì)Pb2+的吸附效果。首先菌齡設(shè)定為 16，24，48，72，96 h，鉛質(zhì)量濃度為100 mg/L，溶液初始pH值，接菌量5 g/L（干菌量），置于30℃搖床吸附2 h，離心收集上清液，采用火焰原子分光光度計(jì)測(cè)定，確定最佳菌齡，然后依次確定 pH 值（2，3，4，5，6，7.5）、接菌量（0.5，2.5，5，7.5，10 g/L）、溫度（20，25，30，35，40 ℃）和時(shí)間（5，10，30，60，90，120 min）的最佳值，最后研究初始鉛質(zhì)量濃度（50，100，200，300，400，500 mg/L）的最佳值，以不接菌為對(duì)照。

1.2.2 吸附動(dòng)力學(xué) 將含Pb2+溶液（500 mg/L）與一定量的菌懸液混合（接菌量為5g/L），30℃，180 r/min振蕩吸附，以不加菌體為對(duì)照，每隔一段時(shí)間取部分離心分離，測(cè)定上清液中Pb2+含量，直至其達(dá)到吸附平衡狀態(tài)。吸附動(dòng)力學(xué)模型如表1所示，其中，qt表示時(shí)間t時(shí)菌體的吸附量，qe表示吸附平衡時(shí)菌體的吸附量，k1，k2，A，B為動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)[19]。

表1 吸附動(dòng)力學(xué)方程模型

1.2.3 等溫吸附模型 配制不同Pb2+質(zhì)量濃度的溶液（100，200，300，400，500 mg/L），加入一定量的菌懸液（接菌量為5 g/L），30℃，180 r/min振蕩吸附到平衡，以不接菌的含鉛溶液為對(duì)照，取上清液測(cè)定吸附平衡時(shí)的Pb2+質(zhì)量濃度，并將試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合。

1.2.4 透射電鏡與紅外光譜分析 收集吸附Pb2+前后的菌樣，樣品經(jīng)固定、脫水、包埋、切片、染色等步驟，制備超薄菌株切片，置透射電鏡下觀察；將吸附Pb2+前后的菌體真空干燥，采用紅外光譜儀測(cè)定并記錄其光譜。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)、圖表進(jìn)行處理；采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、回歸分析等，并采用Origin 8進(jìn)行紅外光譜的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 活細(xì)胞吸附方式的選擇

生物吸附包括活細(xì)胞和死細(xì)胞的吸附。本試驗(yàn)的研究目的是篩選耐鉛菌株并用于土壤重金屬污染的生物修復(fù)，因此，本試驗(yàn)適合以活細(xì)胞吸附為研究對(duì)象?；罴?xì)胞吸附又分為有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的生長(zhǎng)菌株過(guò)程吸附和無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的活細(xì)胞吸附。由圖1可知，隨著鉛離子質(zhì)量濃度的提高，2種活細(xì)胞吸附效果均呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，生長(zhǎng)菌株過(guò)程吸附均比無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的活細(xì)胞吸附效果差，且生長(zhǎng)菌株過(guò)程吸附作用時(shí)間較長(zhǎng)。

研究菌株GDYX03的活細(xì)胞吸附方式發(fā)現(xiàn)，無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的活細(xì)胞吸附比生長(zhǎng)菌株過(guò)程吸附效果好，原因是生長(zhǎng)菌株過(guò)程吸附中因其細(xì)胞受重金屬離子的毒害作用而影響其生長(zhǎng)發(fā)育，其次后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不足、生長(zhǎng)環(huán)境的變化等多種不可控因素也會(huì)限制細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而影響其胞外吸附。而無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的活細(xì)胞吸附雖然胞內(nèi)積累會(huì)因沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供而受到影響，但大量前期培養(yǎng)好的菌體依舊可以通過(guò)表面吸附來(lái)去除重金屬離子，且其吸附效果較好，表明該菌株吸附作用以胞外吸附，即表面吸附為主，可能發(fā)生了表面絡(luò)合，或離子交換、靜電吸附，或表面微沉淀，或者多種機(jī)制共同作用[20-21]，其還有待進(jìn)一步證實(shí)。

2.2 不同條件下耐鉛菌株對(duì)Pb2+的吸附能力

2.2.1 菌齡 由圖2-a可知，取斜面上一接菌環(huán)菌種于100 mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h離心所得菌體吸附效果最佳，吸附率為95.414%，吸附量為18.783 mg/g，隨著菌齡的升高或是降低，其吸附率與吸附量均減小，原因是菌體細(xì)胞壁膜的某些成分與含量隨菌株的生長(zhǎng)而變化。陳志英等[22]研究了菌齡對(duì)菌株吸附銅離子能力的影響，結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)期的菌株對(duì)Cu2+吸附能力有顯著差異，其主要原因是細(xì)胞壁膜中磷脂和脂多糖的含量隨菌齡而變化，導(dǎo)致菌株吸附Cu2+的能力也隨菌齡而變化。因此，在其他相應(yīng)條件下，菌株GDYX03培養(yǎng)72 h時(shí)，其細(xì)胞壁膜對(duì)Pb2+的吸附作用處于最佳狀態(tài)。

2.2.2 pH值 由圖2-b可知，pH值對(duì)菌株吸附Pb2+的影響較大，隨著pH值的增加，菌株吸附率由16.595%上升至98.366%；當(dāng)pH值為6時(shí)，吸附率最高；當(dāng)pH值高于7時(shí)，吸附效果開始降低。KIRAN等[23]和KAPOOR等[24]研究表明，溶液pH可通過(guò)影響菌株表面吸附位點(diǎn)的活性及重金屬離子的形態(tài)來(lái)影響生物吸附作用。pH較低時(shí)，大量的H+和H3O+與金屬離子競(jìng)爭(zhēng)菌體表面的吸附位點(diǎn)，隨著pH值的升高，H+與細(xì)胞壁上的官能團(tuán)分離，細(xì)胞表面更多帶有負(fù)電荷的官能團(tuán)開始暴露，吸附位點(diǎn)增多，吸附效果增強(qiáng)，但當(dāng)pH大于離子的微沉淀點(diǎn)時(shí)，溶液中鉛離子會(huì)形成Pb（OH）2沉淀，阻礙細(xì)胞表面部分載體的協(xié)助運(yùn)輸，從而影響吸附效果，其結(jié)論正如ADNAN等[25]的研究。菌株吸附作用后，溶液pH值由原來(lái)的弱酸性變成弱堿性，說(shuō)明菌株吸附過(guò)程會(huì)產(chǎn)生堿性分泌物，與鉛離子形成表面沉淀，該作用可能是菌株吸附的一個(gè)重要途徑。

2.2.3 接菌量 由圖2-c可知，隨著接菌量的增加，菌株對(duì)Pb2+的吸附率也隨之增加，但吸附量逐級(jí)減小，當(dāng)接菌量達(dá)到5 g/L時(shí)，其吸附率達(dá)到最高，為98.318%，吸附量為19.73 mg/g，原因是隨著接菌量的增加，菌體表面的活性位點(diǎn)增加，從而與Pb2+充分接觸，達(dá)到較好的吸附效果，但當(dāng)接菌量過(guò)量后，菌體易發(fā)生聚集現(xiàn)象，活性位點(diǎn)之間發(fā)生靜電排斥，不利于菌株對(duì)鉛離子的吸附，根據(jù)ACHARY等[26]和SELATNIA等[27]的研究，生物吸附量在很大程度上確實(shí)會(huì)受到吸附劑劑量的制約。BHAINSA等[28]的研究結(jié)果也表明，接菌量對(duì)菌株的吸附效果影響顯著，其作用機(jī)理與本研究看法相一致。但ZUMRIYE[29]則研究認(rèn)為，由于菌體表面對(duì)Pb2+的結(jié)合位點(diǎn)強(qiáng)弱不同，菌體過(guò)多導(dǎo)致它們之間發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，使得結(jié)合位點(diǎn)不能夠充分利用而降低了吸附效果。綜合考慮吸附效果與菌株的利用率，最佳接菌量選擇5 g/L，這樣既可以有效去除重金屬離子，還可以降低操作成本。

2.2.4 溫度 由圖2-d可知，溫度對(duì)吸附作用有少量的影響，當(dāng)溫度小于30℃時(shí)，吸附率與吸附量隨著溫度的升高而增大，其原因可能是菌株在吸附重金屬的過(guò)程中，溫度的升高為其在主動(dòng)吸附過(guò)程中提供了所需能量，因而，提高了其吸附效果；而當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，吸附效果開始降低，因?yàn)楦邷貢?huì)影響菌體的正常代謝，且易破壞活性位點(diǎn)。FAN等[30]研究發(fā)現(xiàn)，某菌株吸附Pb2+時(shí)，溫度的變化會(huì)影響菌體對(duì)重金屬的親和力和其表面的吸附位點(diǎn)；黃飛等[20]研究也表明，溫度不僅可以影響重金屬離子與細(xì)胞表面官能團(tuán)絡(luò)合物的穩(wěn)定性，而且還可以通過(guò)改變細(xì)胞表面官能團(tuán)的電離程度來(lái)影響吸附劑與重金屬離子之間的親和力，其作用效果與本研究相一致。因此，最終選擇菌株的最佳吸附溫度為30℃。

2.2.5 時(shí)間 從圖2-e可以看出，在初始質(zhì)量濃度為100mg/L的溶液中，菌株吸附作用5 min時(shí)，吸附率達(dá)到88.288%，在30 min時(shí)，吸附率達(dá)到98.752%，因此，菌株吸附作用是一個(gè)非?？焖俚倪^(guò)程。VOLESKY[31]的研究也表明，吸附的初級(jí)階段是非常迅速的且不消耗能量。該菌株在吸附時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，吸附效果有少量的提升，說(shuō)明該吸附作用還存在一種吸附方式，當(dāng)吸附作用超過(guò)一定時(shí)間時(shí)，吸附效果開始有所下降，說(shuō)明該作用過(guò)程中存在脫吸附現(xiàn)象。許旭萍等[32]研究發(fā)現(xiàn)，由于該吸附過(guò)程快速，且存在脫吸附現(xiàn)象，推測(cè)該菌株吸附機(jī)理可能主要是菌體表面吸附，但隨著時(shí)間的增加，還有少量鉛被菌體吸附，說(shuō)明該吸附過(guò)程還存在少量的胞內(nèi)積累。綜合考慮，最終選擇30 min為最佳吸附時(shí)間。

2.2.6 初始質(zhì)量濃度 從圖2-f可以看出，在溶液中含Pb2+質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)，菌株GDYX03吸附效果最佳，吸附率和吸附量分別為98.852%和17.793 mg/g，分析是由于在低質(zhì)量濃度Pb2+條件下，溶液中Pb2+與菌體表面吸附位點(diǎn)接觸率高，吸附效果好，當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度大到一定程度時(shí)，離子間的斥力增強(qiáng)，吸附位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)，且有部分菌體裂解或自溶，導(dǎo)致吸附效果不佳。徐雪芹等[33]在研究菌株吸附廢水中Pb2+和Cu2+的機(jī)理中也證實(shí)，溶液中Pb2+的初始濃度對(duì)菌株吸附效果影響較大，原因是不同的初始濃度影響菌體表面吸附位點(diǎn)的活性，從而影響其吸附效果。綜合考慮，最佳初始質(zhì)量濃度選擇100 mg/L。

2.3 吸附動(dòng)力學(xué)分析

動(dòng)力學(xué)用來(lái)描述吸附劑與吸附質(zhì)作用的速率快慢，常常采用Lagergren一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型和Pseudo二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型來(lái)模擬其試驗(yàn)數(shù)據(jù)，探討生物吸附機(jī)理和吸附過(guò)程[20]。本研究對(duì)菌株活細(xì)胞進(jìn)行了幾種動(dòng)力學(xué)方程的擬合，擬合結(jié)果列于表2。

表2 菌株吸附Pb2+動(dòng)力學(xué)模型擬合

由表2可知，二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合系數(shù)最高，R2為0.999，且通過(guò)對(duì)t/qt和t作圖（圖3-a），計(jì)算得到的 k2＝0.023 1，qe＝35.714，與實(shí)測(cè)平衡吸附量十分接近，說(shuō)明二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能夠較好地描述菌株的整個(gè)吸附過(guò)程[20]，與黃志鈞等[34]在研究抗銅離子菌株時(shí)的結(jié)論所一致。二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程揭示出菌株吸附過(guò)程包含多個(gè)步驟的反應(yīng)，其可能是物理吸附，也可能是化學(xué)吸附，還可能是生物代謝型吸附[19]，因此，該菌株的吸附作用可能是多重重金屬吸附機(jī)理的復(fù)合效應(yīng)，具體作用機(jī)理還有待進(jìn)一步分析。

通過(guò)對(duì)ln（（qe－qt）/qe）和時(shí)間t作圖（圖3-b）發(fā)現(xiàn)，120 min內(nèi)，該菌株吸附過(guò)程較符合Lagergren一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，R2為0.975，當(dāng)吸附時(shí)間超過(guò)120 min后，方程的回歸系數(shù)逐漸降低。一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程是基于反應(yīng)物濃度與反應(yīng)速度之間調(diào)控關(guān)系的方程，即溶液中重金屬的濃度對(duì)吸附速度會(huì)有一定的影響[19]，一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程只能較好地模擬該菌株吸附反應(yīng)的初始階段，說(shuō)明溶液中重金屬的濃度對(duì)菌株吸附初期的反應(yīng)速度起決定性影響，但吸附后期反應(yīng)物濃度不是控制吸附作用的決定性因素，因此，該菌株對(duì)鉛的吸附過(guò)程不是單一的作用機(jī)理，與二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型分析得出的結(jié)論一致。

其次，菌株吸附數(shù)據(jù)與顆粒內(nèi)擴(kuò)散方程和Elovich方程擬合系數(shù)R2分別為0.611和0.859，其擬合相關(guān)性不如二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，說(shuō)明Pb2+在顆粒內(nèi)部的擴(kuò)散對(duì)反應(yīng)速度的影響不大，但吸附過(guò)程部分受擴(kuò)散因子的調(diào)控，結(jié)果表明，菌株活細(xì)胞吸附機(jī)理存在多重復(fù)合作用。動(dòng)力學(xué)研究表明[35]，當(dāng)吸附反應(yīng)速率很快時(shí)，總吸附速率由膜擴(kuò)散、內(nèi)擴(kuò)散或二者共同控制，菌株GDYX03活細(xì)胞顆粒內(nèi)擴(kuò)散不明顯，因此，吸附速率以膜擴(kuò)散作用為主，推測(cè)在整個(gè)吸附過(guò)程中，表面吸附起到了主導(dǎo)作用，但還有少量的胞內(nèi)積累。綜合分析，二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程能較好地描述菌株活細(xì)胞吸附Pb2+的整個(gè)過(guò)程，可為生物吸附反應(yīng)器的設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。

2.4 等溫吸附方程

等溫吸附模型用來(lái)描述吸附劑與吸附液中重金屬離子之間的平衡關(guān)系，Langmuir等溫吸附模型較常用，F(xiàn)reundlich等溫吸附模型為經(jīng)驗(yàn)公式，二者均需在相應(yīng)的理想條件下進(jìn)行模型擬合[36-37]。

式中，qm為最大吸附量，qe為單分子層吸附達(dá)到平衡時(shí)的吸附量，Ce為平衡吸附的重金屬濃度，k1為與吸附自由能相關(guān)的Langmuir吸附平衡常數(shù)。

RL為平衡參數(shù)，可用于反映吸附劑和吸附物之間的關(guān)系，RL在0～1間表示吸附劑吸附，RL＝0吸附反應(yīng)不可逆，RL＝1為線性，RL＞1不利于吸附反應(yīng)進(jìn)行[38]。其方程如下。

其中，C0為溶液的不同初始濃度。

其中，k2為與吸附能力有關(guān)的Freundlich吸附平衡常數(shù)，1/n為與吸附強(qiáng)度相關(guān)的經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，受材料不均勻度影響。n值的大小可說(shuō)明吸附作用的線性程度，當(dāng)n＝1時(shí)，吸附為線性，當(dāng)n＜1時(shí)，為化學(xué)吸附，當(dāng)n＞1時(shí)，為物理吸附[39]。

將菌體對(duì)Pb2+吸附的數(shù)據(jù)按吸附等溫方程進(jìn)行擬合、回歸分析，相關(guān)參數(shù)如表3，4所示，其擬合效果較好，運(yùn)用SPSS軟件得到Langmuir擬合方程和Freundlich擬合方程。

表3 等溫吸附方程回歸Langmuir擬合計(jì)算得到的相關(guān)參數(shù)

表4 等溫吸附方程回歸Freundlich擬合計(jì)算得到的相關(guān)參數(shù)

結(jié)果顯示，菌株對(duì)Pb2+吸附的Langmuir等溫吸附模型R2為0.996，F(xiàn)reundlich等溫吸附模型R2為0.831，表明該菌株的吸附過(guò)程更適合用Langmuir等溫吸附模型來(lái)描述。在最佳吸附條件下，隨著Pb2+初始質(zhì)量濃度的增加，平衡參數(shù)RL減少，且RL在0～1之間，表明菌株活細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附是有利的，該吸附劑可以較好地用于Pb2+的吸附。

2.5 透射電鏡分析

通過(guò)透射電鏡對(duì)菌體活細(xì)胞內(nèi)部形態(tài)進(jìn)行觀察，由圖4-a可知，菌株GDYX03呈短桿狀，倆端鈍圓，在沒(méi)有和鉛離子接觸時(shí)，菌體周圍呈電子透明層；在鉛離子初始質(zhì)量濃度為100 mg/L條件下（圖4-b），細(xì)胞表面和內(nèi)部都不規(guī)則地堆積著大量具有衍射現(xiàn)象的電子不透明小顆粒，表明菌株GDYX03吸附鉛離子過(guò)程不但有快速的表面吸附，還發(fā)生了緩慢的胞內(nèi)積累，但胞內(nèi)積累作用不大，分析其原因：一是在吸附過(guò)程中，由于沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的提供，菌體無(wú)法進(jìn)行正常的生理代謝，從而影響細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸，鉛離子無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部；二是在鉛離子質(zhì)量濃度為100 mg/L條件下，菌體通過(guò)減少胞內(nèi)積累量來(lái)保護(hù)自身，避免毒害作用；而當(dāng)菌體在Pb2+質(zhì)量濃度1 000 mg/L條件下（圖4-c），細(xì)胞表面的顆粒量比鉛離子質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)的數(shù)量少，但細(xì)胞內(nèi)部顆粒數(shù)量增多，說(shuō)明當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度大到一定程度時(shí)，離子間的斥力增強(qiáng)，吸附位點(diǎn)處于飽和狀態(tài)，細(xì)胞表面還可能發(fā)生脫吸附現(xiàn)象，因此，表面吸附作用降低，而細(xì)胞內(nèi)外濃度差增大，促進(jìn)胞內(nèi)積累，但整體吸附作用效果下降。因此，可初步認(rèn)為，在無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的條件下，菌株GDYX03適用于低濃度Pb2+污染的修復(fù)，其吸附作用以菌體細(xì)胞表面吸附為主要作用機(jī)制，或?qū)b2+還原為Pb原子，又或與胞外某些陰離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)形成沉淀聚集在細(xì)胞表面，而胞內(nèi)積累作用不大，金羽等[40]在研究耐鉛細(xì)菌的吸附特性中也證實(shí)了該結(jié)果。

2.6 紅外光譜分析

按照文獻(xiàn)[40]對(duì)比分析吸附重金屬前后菌體的紅外光譜（圖5），結(jié)果表明，IR譜圖出現(xiàn)明顯差異，集中表現(xiàn)在微生物分析靈敏區(qū)500～1 800，2 800～3 500 cm-1[41]，吸附重金屬后部分基團(tuán)的吸收峰都發(fā)生變化，菌株在低質(zhì)量濃度Pb2+100 mg/L的溶液中作用時(shí)，與不含Pb2+相比，其IR譜圖基本類似，部分峰位發(fā)生微移，胺基-NH2的最大吸收位置從3 276.52 cm-1遷移到 3 283.26 cm-1，烷基 CH2反對(duì)稱伸縮吸收峰從2994.48cm-1遷移到3000.26cm-1，糖類CH3，CH2，CH伸縮對(duì)稱最大吸收位置從2916.37cm-1遷移到2923.60cm-1；菌株在高質(zhì)量濃度Pb2+500mg/L條件時(shí)，更多基團(tuán)的峰位發(fā)生偏移，烷基CH2反對(duì)稱伸縮吸收峰從2994.48cm-1遷移到3006cm-1，糖類CH3，CH2，CH伸縮對(duì)稱最大吸收位置從2916.37cm-1遷移到2 930.35 cm-1，羰基C=O伸縮振動(dòng)吸收峰從1 635.37 cm-1遷移到1 641.63 cm-1，帶N-H彎曲振動(dòng)與C-N伸縮振動(dòng)的疊加位置從1 578.96 cm-1遷移到1 586.67 cm-1，醇類C-OH伸縮振動(dòng)的最大吸收峰從1 027.41 cm-1遷移到1 025.48 cm-1，膦酸OP-O對(duì)稱伸縮位置從887.59cm-1遷移到894.34cm-1。結(jié)果表明，官能團(tuán) -NH2，CH2，C＝O，C-OH，O-P-O是主要的吸附位點(diǎn)，-NH2在低濃度時(shí)，可提供孤對(duì)電子與Pb2+配位結(jié)合，正如PETHKAR等[42-44]的研究；酰胺I，II帶譜峰也發(fā)生了偏移，說(shuō)明蛋白質(zhì)中的酰胺基也可能起作用，或是糖類、脂類物質(zhì)，黃飛等[20]也證實(shí)了該結(jié)論。但是通過(guò)圖5發(fā)現(xiàn)，吸附后IR譜圖的吸收峰強(qiáng)度或峰形基本沒(méi)有變化，而且沒(méi)有新的譜帶出現(xiàn)，表明菌株吸附過(guò)程中，細(xì)胞成分的活性基團(tuán)與Pb2+發(fā)生絡(luò)合作用，但不是主要的作用機(jī)制。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高耐鉛土著菌GDYX03的活細(xì)胞對(duì)鉛離子的吸附過(guò)程中，無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的菌體活細(xì)胞吸附比生長(zhǎng)過(guò)程菌株的吸附效果好，且無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)提供的活細(xì)胞吸附以胞外吸附為主。

取5 g/L（干菌量）培養(yǎng)72 h的活細(xì)胞于pH值5～6、初始Pb2+質(zhì)量濃度100 mg/L的溶液中，30℃振蕩作用30 min，此時(shí)吸附效果最好，吸附率為98.852%，吸附量為19.73 mg/g。分析其原因可知，該菌株吸附效果主要受菌體表面活性位點(diǎn)的影響，吸附過(guò)程中發(fā)生了離子交換、表面微沉淀、靜電吸附、表面絡(luò)合等。

菌株GDYX03的整個(gè)吸附過(guò)程能很好地符合Pseudo二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，表明其吸附作用是多種重金屬吸附機(jī)理的復(fù)合效應(yīng)，可能是物理吸附，也可能是化學(xué)吸附，還可能是生物代謝型吸附，結(jié)合其他動(dòng)力學(xué)模型分析，該吸附過(guò)程以膜擴(kuò)散為主，即主要是胞外吸附，還有少量的胞內(nèi)積累。Langmuir等溫吸附模型也能很好地描述菌株GDYX03對(duì)鉛離子的吸附過(guò)程，平衡參數(shù)RL在0～1之間，表明菌株活細(xì)胞對(duì)Pb2+的吸附是有利的，可較好地用于對(duì)Pb2+的吸附。

通過(guò)透射電鏡分析菌株GDYX03吸附重金屬前后細(xì)胞內(nèi)部的變化情況，結(jié)果表明，菌株對(duì)Pb2+的吸附主要是細(xì)胞表面的吸附，具有衍射現(xiàn)象的電子不透明小顆?；蚴荘b2+還原為Pb原子，或是與胞外某陰離子絡(luò)合反應(yīng)形成沉淀。而紅外光譜分析可得出，細(xì)胞成分中 -NH2，CH2，C=O，C-OH，O-P-O及酰胺基等是吸附作用中發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)的主要活性基團(tuán)，但該作用不是主要機(jī)制。

綜上可知，菌株GDYX03活細(xì)胞吸附過(guò)程主要是靠細(xì)胞的胞外作用，以化學(xué)、物理吸附為主要作用機(jī)理，如靜電吸附、離子交換、表面絡(luò)合、表面微沉淀等多重復(fù)合吸附機(jī)理共同影響菌株的吸附效果，還有部分胞內(nèi)積累作用，且證明菌株GDYX03可用于低質(zhì)量濃度Pb2+污染土壤的生物修復(fù)。