楊秀麗，寧東賢，趙玉坤

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所，山西 臨汾 041000）

目前，國內(nèi)市場絕大多數(shù)推廣品種的親本是伏花生和獅頭企，或者是含有它們的血緣[1]。然而，過多使用遺傳背景相同或相似的親本材料，導(dǎo)致了栽培種花生基因的大量流失，其遺傳基礎(chǔ)日益狹窄、遺傳變異率低，使得有性雜交重組中無法創(chuàng)造新的基因變異，優(yōu)異性狀的產(chǎn)生受到限制，無法獲得在農(nóng)藝性狀和品質(zhì)上突出的花生品種[2-3]。因此，在花生遺傳育種工程中，需要一種有效方法來解決這些問題，創(chuàng)制出農(nóng)藝性狀優(yōu)良、適應(yīng)性強(qiáng)、配合力高和遺傳基礎(chǔ)廣泛的優(yōu)異新種質(zhì)[4-5]。

通過化學(xué)劑誘導(dǎo)植物變異，短時(shí)間內(nèi)可以獲得大量變異性狀，再經(jīng)過選擇育成新材料或新品種，這種方法產(chǎn)生了一般常規(guī)方法難以獲得的新性狀和新基因，具有獨(dú)特的優(yōu)勢[6-7]。EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）是一種高效、穩(wěn)定和良好的化學(xué)誘變劑，目前在誘變育種中應(yīng)用最為廣泛，效果也最好[8-9]。前人利用EMS在花生種質(zhì)創(chuàng)新上取得了一些成果。SIVARAM[10]、朱保葛等[11]用EMS處理花生種子，均選育出高產(chǎn)品系。FANG等[12]通過EMS誘變處理花生種子，篩選出了1個(gè)油酸含量高達(dá)60%以上的弗吉尼亞型花生突變體e2-4-83-12。殷冬梅等[13]選擇1片子葉但保留完整的胚作為種子外植體進(jìn)行EMS誘變，確定了不同品種的適宜誘變組合。王傳堂等[14]將EMS直接注入花生開放花朵的龍骨瓣內(nèi)，獲得了超大果和超小果的突變體，種子的蛋白質(zhì)含量和粗脂肪含量有明顯提高，油亞比也發(fā)生了改變。魯花12號(hào)是用EMS處理雜交組合的F1果針誘變育成的[15]。

本試驗(yàn)利用EMS處理不同基因型花生品種的種子，以半致死劑量作為可遺傳變異的選擇依據(jù)，研究不同基因型對(duì)EMS的響應(yīng)條件，以期獲得最佳誘變劑量（濃度×?xí)r間）[16-17]，為后續(xù)處理大批量種子提供適宜的誘變條件。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試花生種子 供試花生材料為山西省3個(gè)主栽花生品種：普通型品種晉花8號(hào)，多粒型品種紅四粒和珍珠豆型品種白沙1016，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所花生課題組提供。

1.1.2 供試藥劑 誘變劑EMS（甲基磺酸乙酯），由美國Sigma公司生產(chǎn)，為無色液體。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制 配制pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液 1 000 mL：取 Na2HPO4·12H2O35.82 g定容 1 000 mL，NaH2PO4·2H2O 15.61 g定容 1 000 mL，從 1 000 mLNa2HPO4·12H2O中取 610 mL，1 000 mL NaH2PO4·2H2O中取390 mL，配制成 1 000 mL的磷酸緩沖液，用pH儀調(diào)pH值為7.0，備用。

配制0.5 mol/L硫代硫酸鈉溶液1 000 mL：取Na2S2O3·5H2O124 g定容 1 000 mL，備用。

用蒸餾水浸泡種子9 h，以磷酸緩沖液作為溶劑，配制0.6%和0.9%等2個(gè)濃度的EMS溶液。

1.2.2 EMS誘變 試驗(yàn)設(shè)3個(gè)因素，分別是：A.品種（3個(gè)）；B.誘變濃度（2個(gè)水平）；C.處理時(shí)間（3個(gè)）。每個(gè)品種有6個(gè)處理劑量，分別是 B1C1，B1C2，B1C3，B2C1，B2C2，B2C3。試驗(yàn)因素及水平如表 1 所示。試驗(yàn)共18個(gè)處理，3次重復(fù)，以不添加任何溶液為對(duì)照（CK）。每份材料選取飽滿種子350粒，每50粒裝一瓶，在通風(fēng)櫥中按處理對(duì)每瓶進(jìn)行浸種，標(biāo)記。每個(gè)處理浸種結(jié)束后，在通風(fēng)櫥中加入0.5 mol/L的硫代硫酸鈉，輕搖10 min，倒掉廢液；流水清洗1 h；將種子平鋪在濕潤的濾紙上，保持種子透氣。誘變處理第2天，把M0種子按小區(qū)種植，小區(qū)面積3.0 m2，株距0.2 m，行距0.4 m，每穴1粒。田間種植采用3因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。

表1 試驗(yàn)因素及水平

1.3 測定項(xiàng)目及方法

播種后5 d觀察植株出苗情況，每天早上記錄出苗數(shù)，15 d后計(jì)算出苗勢和出苗率。

出苗勢＝第7天出苗數(shù)/種子總數(shù)×100%；出苗率＝第14天出苗數(shù)/種子總數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對(duì)初始數(shù)據(jù)進(jìn)行平均數(shù)計(jì)算，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變對(duì)花生出苗的影響

經(jīng)EMS誘變的花生種子在播種后出苗受到明顯的抑制。圖1顯示，3個(gè)品種經(jīng)誘變處理后，出苗起始和終止時(shí)間與對(duì)照相比均出現(xiàn)了延遲，出苗數(shù)也都明顯降低。不同處理下各個(gè)品種的出苗趨勢是不一致的，A1和A2在相同的濃度0.6%和浸泡時(shí)間5 h誘變處理（B1C1）下，最終的出苗數(shù)均超過了總數(shù)的1/2，說明在此條件下，植株的損傷程度和產(chǎn)生的變異程度相對(duì)較小，而之后的濃度與時(shí)間組合條件下，出苗數(shù)均沒達(dá)到1/2，致死率較大，植株的受損率較高，后代產(chǎn)生的變異隨之可能會(huì)較大。A3在不同的處理下，最后的出苗數(shù)均沒有達(dá)到1/2，說明該品種在已有的試驗(yàn)條件下對(duì)EMS誘變響應(yīng)條件敏感，容易受到損傷。

表2 3個(gè)基因型品種在不同誘變濃度和浸種時(shí)間組合下的出苗勢情況 %

表3 3個(gè)基因型品種在不同誘變濃度和浸種時(shí)間組合下的出苗率情況 %

3個(gè)品種在不同誘變劑量下的出苗勢和出苗率具體情況如表2，3所示。從表2可以看出，種子經(jīng)誘變后其出苗勢受到很大的影響，種子活力受損，萌發(fā)受到抑制。A1（晉花8號(hào)）在B2C1（濃度0.9%，時(shí)間5 h）的處理下，出苗勢相對(duì)較強(qiáng)；A2（紅四粒）和A3（白沙1016）在B1C1（濃度0.6%，時(shí)間5 h）的處理下，出苗勢相對(duì)較強(qiáng)。從表3可以看出，在B1C1（濃度0.6%，時(shí)間5 h）的處理下，3個(gè)品種的出苗率均最高，A1和A2的出苗率＞50%，說明種子活力受損小，而A3的出苗率為40%，致死率相對(duì)高，說明A3對(duì)誘變劑反應(yīng)敏感[18]。

2.2 品種、EMS濃度和處理時(shí)間對(duì)花生出苗影響的差異分析

本試驗(yàn)為3因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，為了研究這3個(gè)因素對(duì)出苗影響的差異性，對(duì)其進(jìn)行了方差分析和多重比較。由表4可知，對(duì)于2個(gè)出苗指標(biāo)來說，A因素、B因素、C因素、A因素×B因素、A因素×B因素×C因素的F值均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說明每個(gè)因素對(duì)出苗勢和出苗率的影響都是顯著的。另外，不同濃度和浸種時(shí)間存在交互作用，不同品種、濃度和時(shí)間也存在交互作用，說明在同一濃度條件下，不同的浸種時(shí)間對(duì)出苗率的影響顯著不同，而不同基因型的品種，在同樣的濃度和時(shí)間水平下出苗率也是顯著變化的?？梢?，不同基因型的花生品種對(duì)誘變劑的響應(yīng)是不同的，而誘變劑濃度和浸種時(shí)間是否適宜對(duì)誘變效果影響非常大。

表4 3個(gè)因素對(duì)花生出苗率和出苗勢影響的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

由表5可知，2個(gè)誘變劑濃度之間差異性極顯著（P＜0.01），說明濃度越高，植株出苗率越低。當(dāng)EMS濃度增高，植株受到的生理損傷也加大，致死率增大。表6顯示，出苗率在3個(gè)時(shí)間水平下的表現(xiàn)是 C1＞C2＞C3，之間存在極顯著差異（P＜0.01），說明浸泡時(shí)間越長，出苗率越低。

表5 比較2個(gè)誘變劑濃度水平對(duì)出苗率的影響

表6 比較3個(gè)浸種時(shí)間水平對(duì)出苗率的影響

從表7可以看出，不同基因型花生品種對(duì)誘變劑的響應(yīng)存在極顯著差異（P＜0.01），A1（晉花8號(hào)）是普通型品種，A2（紅四粒）是多粒型品種，A3（白沙1016）是珍珠豆型品種，它們對(duì)EMS的敏感反應(yīng)呈遞增趨勢。因此，不同的基因型品種有自身相應(yīng)的最佳誘變劑量。

表7 比較3個(gè)不同基因型對(duì)出苗率的影響

2.3 確定EMS誘變的最佳劑量

不同的基因型品種具有不同的適宜劑量，確定最佳的誘變劑量是誘變育種成功的關(guān)鍵，在適宜劑量下，植株會(huì)產(chǎn)生更多新的變異，并保持自身的優(yōu)良性狀。通常把誘變處理后植株存活50%的劑量（半致死劑量，LD50）作為可遺傳變異的選擇依據(jù)，即最佳誘變劑量[19]。由表2，3可知，A1（晉花8號(hào)）在EMS濃度0.9%，浸泡時(shí)間5 h時(shí)，出苗率為38.6%，且出苗勢最強(qiáng)；A2（紅四粒）在EMS誘變劑量為B1C1（0.6%，5 h）時(shí)，出苗勢最強(qiáng)，但出苗率為71.3%，沒有達(dá)到半致死效果，而在EMS誘變劑量為B1C2（0.6%，7 h）時(shí)，出苗率為39.3%，出苗勢僅次于B1C1處理；A3（白沙1016）在EMS濃度0.6%，浸泡時(shí)間5 h時(shí)，出苗率為40.0%，且出苗勢最強(qiáng)?；谝陨峡紤]，確定A1，A2，A3這3個(gè)品種的最佳誘變劑量分別為 0.9%，5 h；0.6%，7 h；0.6%，5 h。這可以作為之后大批量處理種子的誘變條件。

3 討論

本研究利用EMS處理花生種子，以不同的基因型品種為試材，設(shè)計(jì)2個(gè)誘變濃度水平和3個(gè)浸泡時(shí)間水平，分析出苗勢和出苗率。結(jié)果表明，EMS誘變劑損傷種子活力，抑制萌發(fā)；誘變濃度越高，出苗率越低，而浸泡時(shí)間越長，出苗率也越低；同一濃度水平上，浸泡時(shí)間越長，出苗率越低，而同一時(shí)間水平上，誘變濃度越高，出苗率也越低；不同基因型品種具有不同的誘變適宜濃度。誘變劑的濃度越高，對(duì)植株生理損傷越大，而長時(shí)間浸種導(dǎo)致種子種皮透性增強(qiáng)，使誘變劑與花生種子種皮內(nèi)部結(jié)構(gòu)接觸充分，增強(qiáng)了抑制性。

化學(xué)誘變育種中最佳的誘變劑量既可以保證一定數(shù)量的突變體產(chǎn)生，又可產(chǎn)生更多的可遺傳變異，因此，篩選適宜的誘變劑量是化學(xué)誘變育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，一般以半致死劑量作為選擇依據(jù)。本研究中，確定了晉花8號(hào)、紅四粒和白沙1016的最佳誘變劑量分別是 0.9%，5 h；0.6%，7 h；0.6%，5 h。

利用篩選出的適宜劑量處理大批花生種子，經(jīng)田間種植后，要對(duì)后代進(jìn)行突變體篩選，需要通過對(duì)表型數(shù)據(jù)分析或利用分子生物學(xué)手段，建立突變體庫，獲得優(yōu)異突變體，作為下一步選育或雜合的材料，最終選育出優(yōu)異品種[20]。