楊瑞娟 ，盧 甜 ，閆 蕾 ，李 銳 ，康 晨 ，常麗芳 ，張叢卓 ，白建榮

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，山西 太原 030031；2.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

瞬時表達(dá)分析（Transient expression）是一種可以在短時間內(nèi)分析基因表達(dá)活性的有效方法[1-3]。它基于基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或直接轉(zhuǎn)化法，將外源DNA導(dǎo)入受體植物細(xì)胞，但是該序列不必整合到植物基因組中，就可以暫時高水平表達(dá)。瞬時表達(dá)應(yīng)用廣泛，如外源基因表達(dá)[4]、啟動子功能的分析[5]、蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位[6]等。

磷是主要的營養(yǎng)元素，它不但是植物體內(nèi)核酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)的組成成分，還參與許多植物的基礎(chǔ)生命活動，如能量傳遞和代謝調(diào)控[7]。植物對磷元素吸收主要通過根系吸收磷酸根。雖然土壤總磷含量高，但是土壤中的磷酸根易被各種陽離子和礦物吸附固定或轉(zhuǎn)換成有機(jī)磷而不能被吸收[8-9]。因此，利用植物基因工程培育磷高效吸收新品種具有重要的意義。

本試驗(yàn)將P1502-ZmPHR1與GUS報(bào)告基因相連的融合基因用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入玉米478自交系，通過檢測GUS基因的表達(dá)情況來分析低磷脅迫誘導(dǎo)啟動子P1502-ZmPHR1在玉米中的表達(dá)活性，旨在為通過轉(zhuǎn)基因工程培育玉米磷高效利用的品種提供有效的啟動子。

1 材料和方法

1.1 材料

玉米478自交系和根癌農(nóng)桿菌GV3101-1305-P1502-ZmPHR1菌株為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所分子設(shè)計(jì)育種課題組保存，質(zhì)粒為P1502-ZmPHR1∶GUS[11]，其結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。培養(yǎng)基為 LB固體培養(yǎng)基以及M1（農(nóng)桿菌感染液）、M2（共培養(yǎng)基）、M3（誘導(dǎo)培養(yǎng)基）、M4（篩選培養(yǎng)基）和YEP液體培養(yǎng)基[12]。

1.2 玉米幼胚的轉(zhuǎn)化

1.2.1 農(nóng)桿菌準(zhǔn)備 LB固體培養(yǎng)基（含卡納霉素）上劃線培養(yǎng)待轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，28℃下培養(yǎng)2～3 d。用接種環(huán)取適量農(nóng)桿菌單菌落懸浮在M1培養(yǎng)基中，旋渦混勻，使農(nóng)桿菌稀釋液OD600為0.79～0.85[12]。

1.2.2 幼胚準(zhǔn)備 選取授粉8～10 d的玉米穗，去掉苞葉，使用20%的NaClO溶液消毒20 min，用解剖刀和匙突除去胚乳，挑選（1.0～1.5 mm）幼胚于M1培養(yǎng)基的離心管。

1.2.3 接種和共培養(yǎng) 吸去離心管中的M1培養(yǎng)基，然后加入1 mL農(nóng)桿菌感染液，最大速度渦旋30 s，室溫靜止5 min。將幼胚轉(zhuǎn)到M2共培養(yǎng)基上，并全部平放（盾片朝上）在培養(yǎng)基上，組織培養(yǎng)箱中22℃培養(yǎng)2～3 d。

1.2.4 愈傷組織誘導(dǎo)、選擇與低磷脅迫處理 將幼胚轉(zhuǎn)到M3培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)10～12 d之后，將愈傷組織轉(zhuǎn)到M4培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)14 d。挑選正常生長的愈傷組織（淡黃色）分別轉(zhuǎn)至低磷MS固體培養(yǎng)基（KH2PO4含量為MS培養(yǎng)基的1/1 000[10]）脅迫處理2 d。

1.3 玉米成熟種子的轉(zhuǎn)化

1.3.1 菌液的制備 挑取農(nóng)桿菌單菌落（含目的基因）接種到裝有50 mL的YEP液體培養(yǎng)基（含卡那霉素50 μg/mL）的三角瓶中，28℃，200 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)至對數(shù)期。5 000 r/min離心10 mim，棄上清；用MS液體培養(yǎng)基重懸菌體，懸浮液稀釋至OD600＝0.8左右時，加入乙酰丁香桐（Acetosyringone，AS），使?jié)舛冗_(dá)到 100 μmol/L[13]。

1.3.2 玉米種子預(yù)處理 挑選飽滿的玉米478種子，無菌水沖洗表面污物之后，用20%的NaClO溶液消毒20 min，用無菌水沖洗5次，置于滅菌的三角瓶，加入適量無菌水，28℃，100 r/min培養(yǎng)24 h。在超凈工作臺，用解剖刀劃傷吸水膨脹種子胚生長點(diǎn)，放入新的廣口瓶中[14]。

坡降較陡的區(qū)域，入庫河道河槽狹窄，岸線蜿蜒曲折，河床坡降較大，河床淺灘和深潭交錯。坡降較緩的區(qū)域，河槽變寬，岸線曲率較小，河床坡降較小，尤其在入庫河口區(qū)段，入庫河道多出現(xiàn)沙洲岔道，以U形或?qū)扺形斷面形態(tài)為主。

1.3.3 農(nóng)桿菌侵染萌動玉米種子 把劃過胚的無菌玉米萌動種子浸入準(zhǔn)備好的菌液，28℃，90 r/min共培養(yǎng)12 h，無菌紙吸干多余的菌液，玉米種子分別置于MS液體培養(yǎng)基和無菌水（脅迫處理），28℃，90 r/min培養(yǎng)2 d。

1.4 GUS組織的化學(xué)染色

參照J(rèn)EFFERSON等[15]的方法，分別將轉(zhuǎn)基因愈傷組織和發(fā)芽種子，轉(zhuǎn)入裝有適量GUS染液的離心管中，37℃過夜，75%乙醇脫色3次，在解剖顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 P1502-ZmPHR1啟動子在玉米幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)和瞬時表達(dá)

將未轉(zhuǎn)化的幼胚及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后的幼胚培養(yǎng)14 d后，未轉(zhuǎn)化的幼胚和轉(zhuǎn)P1502-ZmPHR1啟動子玉米478幼胚均誘導(dǎo)長出愈傷組織（圖2）。

轉(zhuǎn)基因后有169個幼胚產(chǎn)生愈傷組織。將100塊轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的每一塊愈傷組織分為2塊，其中一塊進(jìn)行低磷脅迫誘導(dǎo)，另一塊不進(jìn)行低磷脅迫誘導(dǎo)；同時，將非轉(zhuǎn)基因50個幼胚產(chǎn)生的愈傷組織的每一塊也分為2塊，其中一塊進(jìn)行低磷脅迫誘導(dǎo)，另一塊不進(jìn)行低磷脅迫誘導(dǎo)。然后將這4部分愈傷組織進(jìn)行GUS染色。結(jié)果表明，未經(jīng)低磷脅迫培養(yǎng)基誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因玉米幼胚愈傷組織均未染色（圖3-A，B），低磷脅迫培養(yǎng)基誘導(dǎo)2 d后轉(zhuǎn)基因玉米幼胚愈傷組織局部染為藍(lán)色（圖3-C），而非轉(zhuǎn)基因幼胚愈傷組織（陰性對照）不論脅迫與否均未染色（圖3-B，D）。表1結(jié)果顯示，GUS染色率為6%。結(jié)果表明，P1502-ZmPHR1啟動子轉(zhuǎn)入了玉米478幼胚愈傷組織后，低磷條件下P1502-ZmPHR1啟動子能驅(qū)動GUS報(bào)告基因在玉米478幼胚愈傷組織中表達(dá)。

表1 P1502-ZmPHR1在玉米478幼胚愈傷組織的表達(dá)

2.2 P1502-ZmPHR1啟動子在玉米成熟胚中的誘導(dǎo)和瞬時表達(dá)

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別對200粒玉米478成熟種子萌動胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而100粒種子只劃胚不侵染作為陰性對照。并將2種方法處理的種子1/2正常培養(yǎng)，另外1/2進(jìn)行脅迫處理。結(jié)果顯示，使用MS培養(yǎng)基正常培養(yǎng)的玉米478萌動種子和轉(zhuǎn)P1502-ZmPHR1啟動子的萌動種子均未染色（圖4-A，B），經(jīng)無菌水脅迫2 d的轉(zhuǎn)P1502-ZmPHR1啟動子的玉米萌動種子的胚芽、胚根以及胚的邊緣都變?yōu)樗{(lán)色（圖4-C），而無菌水脅迫2 d的玉米478萌動種子仍未染色（圖4-D），說明P1502-ZmPHR1啟動子可以在玉米478萌動種子中誘導(dǎo)驅(qū)動GUS基因表達(dá)。GUS染色結(jié)果表明，僅侵染的種子經(jīng)脅迫處理后變?yōu)樗{(lán)色，染色率為20%（表2）。

表2 P1502-ZmPHR1在玉米478成熟胚中的表達(dá)

3 討論

傳統(tǒng)植物基因工程中使用的啟動子為強(qiáng)組成型啟動子，在植株的整個生命周期中持續(xù)過表達(dá)，不但會造成營養(yǎng)和能量的浪費(fèi)，干擾RNA和蛋白質(zhì)的合成[16]，而且還會導(dǎo)致植物生理活動無法正常進(jìn)行，尤其是與低磷脅迫相關(guān)基因使用組成性啟動子，出現(xiàn)了植株磷中毒的現(xiàn)象。誘導(dǎo)型啟動子僅在植物受到脅迫時調(diào)控基因表達(dá)，可以巧妙地避免上述問題。因此，研究與利用誘導(dǎo)型啟動子成為植物基因工程的熱點(diǎn)。但已報(bào)道的研究多集中于誘導(dǎo)型啟動子在模式植物中，在作物中研究的比較少[17-18]。

本研究在通過轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥驗(yàn)證P1502-ZmPHR1啟動子的功能之后，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別對玉米478的幼胚和萌動成熟種子進(jìn)行轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步分析其在玉米中的表達(dá)模式，完善試驗(yàn)結(jié)果。2組試驗(yàn)結(jié)果均表明，P1502-ZmPHR1啟動子是低磷脅迫誘導(dǎo)型啟動子，在玉米478中有啟動子活性。該結(jié)果為利用基因工程手段培育磷高效利用型玉米品種改良奠定了基礎(chǔ)。下一步我們將進(jìn)行P1502-ZmPHR1啟動子以及ZmPHR1在轉(zhuǎn)基因玉米植株功能鑒定，使之能夠在有效磷缺乏的土壤中正常生長，并且可以在減少磷肥施用量的情況下獲得高產(chǎn)，同時避免磷中毒，從而有效地節(jié)約磷礦資源，降低生產(chǎn)成本，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。