朱喜忠 劉子銘 吳術(shù)紅 熊華章 金瑛 李豫皖 楊繼濱 尤奇 劉毅

1遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院（貴州遵義 563000）

2重慶醫(yī)科大學附屬醫(yī)院骨科（重慶 400000）

韌帶因自身愈合能力有限，其損傷或病變的治療仍是運動醫(yī)學面臨的一大難題[1-3]。據(jù)報道，美國每年有超過200萬例患者因肌腱或韌帶損傷而就診[4]。因此，深入了解韌帶細胞的分化機制對臨床損傷的修復(fù)或重建至關(guān)重要。骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrowderived mesenchymal stem cells，BMSCs）雖已廣泛應(yīng)用于實驗研究[5,6]，但存在取材創(chuàng)傷大、含量低等缺點[7,8]。而人羊膜間充質(zhì)干細胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）具有取材方便、增殖速度快、不存在倫理限制等優(yōu)點，成為近些年的研究熱點[9-11]。

BMP9（生長分化因子2,GDF-2）是已知骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphorgenetic proteins，BMPs）家族中誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞在體內(nèi)和體外成骨分化能力最強的成員[12,13]，但其是否具有誘導(dǎo)干細胞向肌腱分化的能力還鮮有報道。最近有研究表明[14]，BMP9同樣可以激活A(yù)LK1和ALK5受體從而增強細胞外基質(zhì)蛋白的表達。因此，本實驗使用腺病毒載體系統(tǒng)將人BMP9基因?qū)肴搜蚰らg充質(zhì)干細胞中，探討B(tài)MP9能否誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細胞向韌帶細胞定向分化，并研究其分子機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑、儀器

實驗所搜集5個胎盤來自于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院產(chǎn)科足月產(chǎn)產(chǎn)婦，無其他基礎(chǔ)疾病，術(shù)前均簽署知情同意書，符合遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會要求。實驗所搜集3例前交叉韌帶殘端來自于遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，術(shù)前簽署知情同意書，符合遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會要求。

L-谷氨酰胺、L-DMEM/F12培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國）；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Ⅱ型膠原酶（HYCLONE公司，美國）；轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green real-time PCR Master Mix（TAKARA公司，日本）；AdBMP9表達質(zhì)粒、AdGFP空載對照質(zhì)粒（上海漢恒生物科技有限公司）；青霉素、鏈霉素（華北制藥有限公司）；Trizol試劑（Invetrogen公司，美國）；Ⅰ型膠原抗體（Abcam公司，英國）；4%多聚甲醛固定液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）、山羊抗兔 cy3熒光二抗、Triton X-100、山羊血清（北京索萊寶科技有限公司）。

超凈工作臺（北京冠鵬凈化設(shè)備公司）；冷凍離心機（EPPENDORF公司，德國）；倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（OLYMPUS公司，日本）；CO2恒溫箱（THERMOSCIENTIFIC公司，美國）。CFX96型實時定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 人羊膜間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)

根據(jù)本課題組建立的方法分離培養(yǎng)hAMSCs。主要如下：將羊膜從胎盤上剝離，PBS液沖洗干凈后剪成碎片，0.02%EDTA-0.05%胰蛋白酶消化2次，PBS液洗滌后，0.75 mg/mLⅡ型膠原酶消化3 h，收集細胞濾液，以1500 rpm、4℃離心6 min。棄上清，用含10%FBS的L-DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞、計數(shù)并接種，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3 人交叉韌帶成纖維細胞的分離與培養(yǎng)

根據(jù)本課題組建立的酶消化法分離培養(yǎng)韌帶成纖維細胞（Ligament fibroblast cells,LFs），主要如下：將ACL殘端在PBS液中反復(fù)洗滌，剔除多余結(jié)締組織，0.2%的Ⅰ型膠原酶在37℃水浴箱中震蕩消化5 h，收集細胞濾液，以1500 rpm、4℃離心6 min。棄上清，用含10%FBS的L-DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞、計數(shù)并接種，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 AdBMP9體外轉(zhuǎn)染hAMSCs

基于AdMAX系統(tǒng)[pHBAd穿梭質(zhì)粒、腺病毒骨架載體pBHGlox（deltaΔE1,3Cre）雙載體組成]，將構(gòu)建的帶有目的基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒經(jīng)大量抽提（濃度＞1 mg/ml、A260/280 在 1.7～1.8之間）后，于293A細胞中進行包裝（體系：目的基因質(zhì)粒：pBHGlox（deltaΔE1,3Cre）=1∶2）后行篩取、擴增與純化，純化采用PEG8000沉淀-CsCl密度梯度離心-透析聯(lián)用法。隨后使用293細胞對病毒進行梯度法稀釋后培養(yǎng)8 h后觀察綠色熒光表達量，進行病毒滴度（PFU/ml）的測定。

取P3代匯合率50%～75%之間的hAMSCs，棄去培養(yǎng)基后使用PBS洗滌3遍，更換新鮮無血清培養(yǎng)基后，分別添加不同梯度（MOI=3、10、30、100、300；感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）AdBMP9和等滴度同體積的AdGFP，輕搖培養(yǎng)板使其分布均勻，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h后更換為含10%FBS的L-DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后觀察熒光表達量并計算合適的MOI值。

取P3代匯合率50%～75%之間的hAMSCs，棄去培養(yǎng)基后使用PBS洗滌3遍，更換新鮮無血清培養(yǎng)基后添加MOI=10的AdBMP9和AdGFP，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 h后更換為含10%FBS的LDMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，此后每48 h換液[15]。

1.5 觀測指標

1.5.1 hAMSCs和LFs的比較

倒置相差顯微鏡觀察：原代培養(yǎng)24 h后和P3代培養(yǎng)24 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況。

1.5.2 轉(zhuǎn)染效率檢測

①倒置相差顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染后8 h、24 h于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)和生長情況。②熒光顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染后8 h、24 h于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.5.3 實驗分組

A組：攜帶綠色熒光蛋白（Green Fluorescent Protein,GFP）的空腺病毒載體轉(zhuǎn)染hAMSCs（hAMSCs-GFP）；B組：攜帶BMP9基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染hAMSCs（hAMSCs-BMP9）；C組：韌帶成纖維細胞組（LFs）。所有實驗分組材料均按照上述所制備。各組細胞體外培養(yǎng)7天后進行進一步的實驗檢測。

1.5.4 韌帶相關(guān)分子表達水平檢測

①實時熒光定量PCR檢測：取A、B、C三組細胞分別于培養(yǎng)7 d時檢測SCX、Tnmd、ColⅠ、Fib和TNC的mRNA表達水平。標準Trizol法提取各組細胞的RNA，紫外分光光度計檢測RNA提取質(zhì)量。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法計算目標基因相對表達量。引物在NCBI基因庫中對比后，由上海生工生物工程股份有限公司合成（表1）。②熒光免疫組化分析：A、B、C三組細胞分別以密度為1.5×105/ml的細胞懸液，加入到含直徑25 mm細胞爬片的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)7 d后，取出細胞爬片，按改良Coons細胞免疫熒光染色步驟操作，一抗孵育過夜后，加山羊抗兔Cy3檢測Ⅰ型膠原，熒光顯微鏡觀察。

表1 基因引物序列及產(chǎn)物長度

續(xù)表1

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗；檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hAMSCs和LFs的形態(tài)學觀察

倒置相差顯微鏡觀察：hAMSCs原代時多呈橢圓或多角形貼壁生長，部分區(qū)域可見細胞聚集，細胞核圓形，排列不規(guī)則；傳代培養(yǎng)后以長梭形為主，漩渦狀生長。LFs原代時多以長梭形貼壁生長，細胞核圓形，原代數(shù)量較少；傳代后呈明顯長梭狀生長，可見漩渦狀集落（圖1）。

圖1 人羊膜間充質(zhì)干細胞和人韌帶纖維細胞的形態(tài)（×100）

2.2 轉(zhuǎn)染效率檢測

2.2.1 倒置相差顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染后8 h、24 h鏡下可見細胞生長增殖緩慢，輪廓清晰，細胞形態(tài)未發(fā)生變化。（圖2A、2B）

2.2.2 熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染后8 h可見明顯GFP熒光表達；24 h時表達GFP細胞數(shù)量明顯增多，同時熒光強度也增強（圖2C、2D）。

圖2 病毒轉(zhuǎn)染人羊膜間充質(zhì)干細胞（×200）

2.3 韌帶相關(guān)分子表達水平檢測

2.3.1 實時熒光定量PCR檢測

轉(zhuǎn)染7天后，A組表達SCX、Tnmd、ColⅠ、Fib及TNC均高于B組（P＜0.05），但其SCX、Tnmd、Fib及TNC的表達量低于C組（P＜0.05），而ColⅠ的表達量高于C組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 人羊膜間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)后肌腱細胞相關(guān)基因mRNA的表達

2.3.2熒光免疫組化分析

體外培養(yǎng)7天后，B組ColⅠ的表達量均高于A組和C組，C組ColⅠ的表達量高于A組（P＜0.05）（圖4）。

圖4 免疫熒光檢測各組Ⅰ型膠原表達量（×40）

3 討論

與其他來源的MSCs相比，人羊膜間充質(zhì)干細胞具有取材無創(chuàng)、采集便捷等優(yōu)點[16]，已廣泛應(yīng)用于骨損傷、神經(jīng)性疾病、脊髓損傷等疾病的動物模型體內(nèi)研究，對骨骼肌肉系統(tǒng)損傷的治療具有良好前景[17]。BMPs對于發(fā)育過程中的細胞增殖和分化都發(fā)揮著重要作用，可以調(diào)控間充質(zhì)干細胞向骨、軟骨、脂肪和肌腱等方向分化[18]。BMP9作為其家族中成骨分化能力最強的成員，其能否誘導(dǎo)干細胞向韌帶分化鮮有報道。這可能與BMP12的研究有關(guān)。BMP12具有較強的成韌帶組織能力[19]，有學者在兔模型上采用BMP12基因修飾促進了后交叉韌帶損傷的組織學和生物力學愈合[20]。

傳統(tǒng)的外源性添加誘導(dǎo)因子能夠誘導(dǎo)MSCs向肌腱樣細胞分化[11]，但直接添加外源性生長因子具有價格昂貴、發(fā)揮生物活性時間短、局部濃度不確定等缺點[8]。故本研究通過腺病毒載體系統(tǒng)將人BMP9基因轉(zhuǎn)入hAMSCs，使外源性基因在一定時間內(nèi)高效表達[15]。實驗結(jié)果表明，用BMP9基因修飾hAMSCs后，可明顯促進hAMSCs向韌帶成纖維細胞表型分化并促進韌帶特異性基因表達和細胞外基質(zhì)分泌。但目前尚無單一的表型標記來鑒定成熟的韌帶成纖維細胞，因此本實驗采用實時熒光定量PCR和免疫熒光檢測，從基因和蛋白水平來評價BMP9基因修飾hAMSCs后促進其向韌帶細胞分化的效果，并與LFs相比較。而本實驗中使用的LFs細胞取自膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎全膝置換術(shù)患者，故肌腱細胞的增殖和特異性分子表達能力能否代表正常肌腱細胞還需進一步實驗研究。

轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor beta，TGF-β）超家族為現(xiàn)階段韌帶組織工程中的熱點因子，包括TGF-β1（transforming growth factor beta 1）和骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）家族，而其對種子細胞的誘導(dǎo)作用和途徑卻不盡相同[21]。TGF-β1主要通過介導(dǎo)ALK5的Ⅰ型受體或ALK1受體激活Smad2/3途徑從而促進細胞分化和細胞外基質(zhì)的合成[22]，而BMPs家族對細胞誘導(dǎo)和分化效果主要通過介導(dǎo)ALK2、ALK3和ALK6受體，且不同的BMPs家族亞型對不同來源的細胞誘導(dǎo)效果也不一樣[23]。如BMP12因其具有較強的纖維誘導(dǎo)作用被應(yīng)用于腱骨愈合的研究，而BMP6或BMP7卻抑制種子細胞的纖維化。Herrera等[24]發(fā)現(xiàn)，BMP9作為TGF-β1Ⅰ型受體ALK1的聯(lián)合配體并激活Smad1/5/8途徑促使內(nèi)皮細胞、腎小球系膜細胞及肝癌細胞纖維化。不僅如此，Munoz等[14]發(fā)現(xiàn)BMP9還可激活Smad2/3及MAPK/ErK1/2受體從而增強細胞外基質(zhì)的合成及種子細胞纖維化。既往研究表明ErK1/2被抑制后會降低BMP9的成骨分化效應(yīng)，而BMP9刺激內(nèi)皮細胞后會激活MAPK/ErK1/2受體，這說明MAPK/ErK1/2對于BMP9誘導(dǎo)種子細胞分化可能是另一個重要的途徑[25]。然而BMP9與TGF-β1并不具有協(xié)同作用。Herrera等人還發(fā)現(xiàn)，盡管兩種因子同時作用后比分別單獨使用TGF-β1誘導(dǎo)增強了CAGA啟動子的激活，比單獨使用BMP9誘導(dǎo)減弱了BRE元件的激活，而對于Smad1/5/8和Smad2/3的激活效應(yīng)卻沒有增強。更值得注意的是，經(jīng)BMP9轉(zhuǎn)染后的干細胞在培養(yǎng)過程中額外添加TGF-β1誘導(dǎo)因子復(fù)合誘導(dǎo)后檢測發(fā)現(xiàn)一型膠原及纖維連接蛋白的表達量無明顯改變，這說明BMP9與TGF-β1之間可能存在受體競爭作用[14]。

實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染7天后，B組中SCX、Tnmd、CoⅠ、Fib及TNC的mRNA表達量均高于A組（P＜0.05）。SCX作為肌腱和韌帶發(fā)生和發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子，參與肌腱祖細胞的聚集及分化[26,27]。Ⅰ型膠原是肌腱和韌帶細胞外基質(zhì)的主要組成部分，其對肌腱和韌帶的強度至關(guān)重要[28]。Tnmd是肌腱分化的特異性標記，主要在肌腱和韌帶以及骨骼肌的肌外膜中表達[29]。另一方面，轉(zhuǎn)染7天后，B組SCX、Tnmd、Fib及TNC的mRNA表達量仍顯著低于C組（P＜0.05）。這可能與BMP9的誘導(dǎo)分化能力及時間有關(guān)。但B組CoⅠ的mRNA表達量顯著高于C組（P＜0.05），此結(jié)果相同于熒光免疫組化分析。這可能由多方面因素造成，一是LFs來源問題（OA患者）而導(dǎo)致ColⅠ表達量降低，有研究證明LFs在體外分離培養(yǎng)過程時，其培養(yǎng)周期較長且增殖能力較弱[30]；二是hAMSCs經(jīng)BMP9誘導(dǎo)后確實明顯增加了ColⅠ的表達量，這需要進一步的實驗研究進行驗證。

綜上所述，本研究將人BMP9基因成功轉(zhuǎn)染人羊膜間充質(zhì)干細胞，并誘導(dǎo)其成韌帶細胞分化取得了一定效果，為hAMSCs作為韌帶組織工程種子細胞提供了實驗基礎(chǔ)，同時為BMP9基因作用的研究提供了新的方向。