徐勝威，斯烈鋼，申屠基康，楊 程，沈偉良

（寧波市海洋與漁業(yè)研究院，浙江寧波 315141）

目前進(jìn)出口海產(chǎn)品的安全問(wèn)題備受人們關(guān)注，藥物的殘留問(wèn)題也成為重點(diǎn)檢測(cè)的對(duì)象。在生產(chǎn)實(shí)踐中，不僅要關(guān)注用藥后水產(chǎn)動(dòng)物代謝物對(duì)水產(chǎn)品安全隱患，更需重視抗菌漁藥難降解問(wèn)題，全方位地控制藥物殘留的問(wèn)題，確保在加強(qiáng)治療的同時(shí)做到生態(tài)環(huán)境不遭到不必要的破壞。因此根據(jù)抗菌漁藥特性及藥代動(dòng)力學(xué)特征來(lái)制定一系列合理、科學(xué)的用藥措施顯得尤為重要。

諾氟沙星是一種廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的抗菌藥，屬于第三類喹諾酮類藥物。其抑菌機(jī)理是通過(guò)作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾DNA的復(fù)制而產(chǎn)生抑菌作用。作為一種抑菌效果較好的水產(chǎn)藥物諾氟沙星在水產(chǎn)領(lǐng)域使用較廣泛，在草魚(yú) Ctenopharyngodon idellus[2]、中華鱉Trionyx Sinensis[3]、日本鰻鱺Anguilla japonica[4]、斑節(jié)對(duì)蝦Penaeus monodon[5]等多種水產(chǎn)動(dòng)物中均有報(bào)道。

近年來(lái)，由于凡納濱對(duì)蝦Litopenaeus vannamei的高密度集約化養(yǎng)殖而引起的各類細(xì)菌性病害頻發(fā)。諾氟沙星藥物對(duì)細(xì)菌性疫病療效普遍較好[5]，但此類抗生素的使用安全性越來(lái)越引起重視。農(nóng)業(yè)部2292號(hào)公告中明文禁止了在食品動(dòng)物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑。自2015年12月31日起，停止生產(chǎn)洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星等4種原料藥的各種鹽、脂及其各種制劑，涉及的相關(guān)企業(yè)的獸藥產(chǎn)品批準(zhǔn)文號(hào)同時(shí)注銷，2016年12月31日后禁止流通使用。因此開(kāi)展南美白對(duì)蝦諾氟沙星藥物殘留具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，藥物殘留檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法和一些商品化的快速檢測(cè)試劑盒。但能否在正確時(shí)間段有效檢測(cè)到殘留藥物并估算出用藥量需要有相應(yīng)的基礎(chǔ)性研究。凡納濱對(duì)蝦細(xì)菌性病害通常發(fā)病于高溫季節(jié)，結(jié)合休藥期的長(zhǎng)短可估算出最佳采樣期。目前，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)關(guān)于諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布與消除規(guī)律的報(bào)道。由于用藥濃度、用藥時(shí)間、魚(yú)體規(guī)格及養(yǎng)殖方式的不同諾氟沙星在魚(yú)蝦體內(nèi)代謝規(guī)律會(huì)有較大差異。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)我國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中實(shí)際用藥濃度和用藥時(shí)間研究了養(yǎng)殖模式下諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、組織分布與消除規(guī)律。為諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦中的代謝規(guī)律提供了理論數(shù)據(jù)，并為加強(qiáng)該藥物的管理和監(jiān)督非法使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選用健康無(wú)疾病的凡納濱對(duì)蝦（平均體長(zhǎng) 6.0±0.5 cm，平均體重 1.43±0.21 g）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物暫養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)用凡納濱對(duì)蝦在鹽度為 25，水溫為 28.0±1.0 ℃，pH8.2±0.3 條件下在 1 m3玻璃鋼桶中暫養(yǎng)兩周，氨氮和亞硝酸鹽控制在0.05 mg/L以下，暫養(yǎng)期間投喂不含藥物的對(duì)蝦飼料，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前48 h進(jìn)行饑餓處理。

1.3 病原菌

副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus為從患有急性肝胰腺壞死病的凡納濱對(duì)蝦中分離。

1.4 藥品與儀器

水產(chǎn)常用喹諾酮類藥物（純度>98%，見(jiàn)表1）；諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（純度≧98.0%），乙腈為色譜純，鹽酸、無(wú)水硫酸鈉和四丁基溴化銨為分析純；高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 2695），離心機(jī)（美國(guó)熱電17R），振蕩儀（IKA MS 3 digital）等。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散法（K-B法）和稀釋法測(cè)定幾種常見(jiàn)喹若酮類藥物對(duì)副溶血性弧菌的抑菌效果，篩選出效果最好的一種藥物，并確定抑菌濃度。

1.6 給藥與取樣

根據(jù)《新編漁藥手冊(cè)》的藥物劑量說(shuō)明，進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定諾氟沙星與飼料（粉料）按質(zhì)量比為1:1 000制成顆粒飼料較為合理，控制每顆飼料重約2 mg。將實(shí)驗(yàn)蝦放于長(zhǎng)35 cm寬25 cm的八格塑料盒中，每格放1尾，設(shè)立實(shí)驗(yàn)組（投喂藥餌）和對(duì)照組（投喂不含藥物餌料）。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)每尾蝦投喂10顆飼料，分別在投喂后 0.5、1、2、4、6、8、16、24、48、96 h 等時(shí)間段取樣，連續(xù)跟蹤 18 d。每次取樣時(shí)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各取3尾蝦，每尾蝦取血淋巴、肝胰腺和肌肉樣品稱重并于-80℃保存，用于后續(xù)的藥物含量測(cè)定。每次取樣時(shí)統(tǒng)計(jì)飼料剩余量，并在1 h后將剩余藥餌全部撈出，改喂不含藥物的常規(guī)飼料。

1.7 樣品前處理

1.7.1 血淋巴

向血樣中加入200 μL酸化乙腈（乙腈：50%鹽酸=2 500:20），渦旋混合，加入800 μL流動(dòng)相，混勻離心后過(guò)微孔濾膜，裝高效液相色譜儀專用瓶中，濾液供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.7.2 肝胰腺和肌肉樣品

向肝胰腺和肌肉樣品中加入1mL酸化乙腈，加少量無(wú)水硫酸鈉，渦旋振蕩至充分混勻，離心3min，取上清液至10mL玻璃試管中，再向樣品中加入1mL酸化乙腈，重復(fù)上述操作1次，將兩次收集的上清液混合。置于氮吹儀中氮吹至所收集上清液蒸干，向玻璃試管中加入1mL流動(dòng)相，混合均勻，過(guò)微孔濾膜，裝高效液相色譜儀專用瓶中，濾液供高效液相色譜儀測(cè)定。

1.8 色譜條件

色譜柱 C18柱 （150 mm×4.6 mm）；乙腈：四丁基溴化銨溶液=5:95（V/V）；柱溫：40 ℃；流速：1.5mL/min；激發(fā)波長(zhǎng)：280 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：450 nm，進(jìn)樣量 20 μL。

1.9 回收率測(cè)定

取對(duì)照組的血樣加10 μg/ml的諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL，空白組的肝胰腺和肌肉組織各加10 μg/mL和1 μg/mL諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL，每組做3個(gè)平行，每個(gè)濃度重復(fù)3次測(cè)定回收率，回收率=實(shí)測(cè)藥物濃度/理論藥物濃度×100%。

1.10 數(shù)據(jù)處理

用Origin75軟件做出標(biāo)準(zhǔn)曲線和藥時(shí)曲線，用DAS2.0軟件對(duì)各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行模型擬合和參數(shù)計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)

副溶血性弧菌6種喹若酮類藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，藥敏紙片結(jié)果：副溶血性弧菌對(duì)諾氟沙星最敏感，其次為吡哌酸和鹽酸諾氟沙星。根據(jù)抑菌圈的大小初步篩選出抑菌效果最好為諾氟沙星和吡哌酸，最小抑制濃度（MIC）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示諾氟沙星MIC為0.781 mg/L，吡哌酸MIC為1.563 mg/L。綜合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)副溶血性弧菌抑菌效果最好為諾氟沙星。為進(jìn)一步研究諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的代謝過(guò)程，采用高效液相色譜法測(cè)定諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of drug sensitivity test

2.2 回收率

回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。血淋巴的藥物回收率最高為87.7%，肝胰腺和肌肉組織平均回收率依次為64.15%和63.65%。

表2 諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的回收率Tab.2 The recoveries of norfloxacin in L.vannamei

2.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和藥時(shí)曲線

諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦血淋巴、肌肉、肝胰腺中的分布半衰期（T1/2α）依次為1.047、1.204、1.951 h；消除半衰期（T1/2β）依次為 69.315、14.812、69.315 h；吸收半衰期（T1/2Ka）依次為 0.704、0.954、1.832 h；達(dá)峰時(shí)間（Tmax）依次為 1、4、4 h；達(dá)峰濃度（Cmax）依次為 13.527 5、1.904 4、698.916 7 mg/L；藥時(shí)曲線下面積（AUC）依次為6.764、9.538、7 013.467 mg·h-1·L-1（表3）。

血淋巴的藥時(shí)曲線在0.5～48 h內(nèi)整體處于下降趨勢(shì)，且在0.5～1 h內(nèi)急劇下降，8 h后藥物濃度接近于零；肌肉和肝胰腺的藥時(shí)曲線變化趨勢(shì)基本一致，在0.5～1 h內(nèi)急劇下降，1～4 h緩慢上升并于4 h后開(kāi)始下降；肝胰腺中下降較為緩慢，在14 d時(shí)仍檢測(cè)到微量諾氟沙星，于16 d后下降為零，而肌肉組織于8 h后降為零，這與血淋巴表現(xiàn)一致（圖1～3）。

3 討論

喹諾酮類抗生素因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無(wú)交叉耐藥性和毒副作用小等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中。諾氟沙星是氟喹諾酮類藥物之一，該類藥物吸收較快，藥物進(jìn)入體內(nèi)后大多在2 h內(nèi)達(dá)到血藥濃度最大值，且AUC值較大，生物利用度高，藥效好[6]。本研究通過(guò)藥敏試驗(yàn)，在6種喹諾酮藥物的篩選中發(fā)現(xiàn)引起凡納濱對(duì)蝦弧菌性疾病的副溶血性弧菌對(duì)諾氟沙星最為敏感。李小義等[7]也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論：從患病的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中分離出副溶血性弧菌，通過(guò)抗生素試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)包括諾氟沙星在內(nèi)的多種抗生素敏感。諾氟沙星通過(guò)作用于細(xì)菌的DNA旋轉(zhuǎn)酶，干擾DNA的復(fù)制達(dá)到抑菌效果，廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的抗菌藥，對(duì)細(xì)菌出血性敗血病的敏感度較高，利用該藥在生產(chǎn)應(yīng)用中效果良好[8]。

表3 諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of norfloxacin in L.vannamei

圖1 血淋巴的藥時(shí)曲線Fig.1 The norfloxacin concentrationtime curve of hemolymph

圖2 肌肉的藥時(shí)曲線Fig.2 The norfloxacin concentrationtime curve of muscle

圖3 肝胰腺的藥時(shí)曲線Fig.3 The norfloxacin concentrationtime curve of hepatopancreas

藥代動(dòng)力學(xué)中的 T1/2α、T1/2β、Tmax和 Cmax等是衡量藥物在體內(nèi)吸收速度和程度的重要參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)中，諾氟沙星在血淋巴、肝胰腺、肌肉中的 T1/2α依次為 1.047、1.951、1.204 h，T1/2Ka依次為 0.704、1.832、0.954 h，T1/2β依次為69.315、69.315、14.812 h，表明諾氟沙星在血淋巴中吸收較快，其次是肌肉，在肝胰腺中吸收相對(duì)較慢，而在血淋巴和肝胰腺中殘留時(shí)間較肌肉的長(zhǎng)。房文紅等[5]在斑節(jié)對(duì)蝦藥代研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)一次性肌肉注射諾氟沙星溶液，當(dāng)藥物劑量為10 mg/kg時(shí)，T1/2α和 T1/2β分別為0.0635 h和0.612 h，這與本實(shí)驗(yàn)中的T1/2α和T1/2β的差異較大，此結(jié)果可能和給藥方式與物種差異有關(guān)。青蝦Macrobrachium nipponense在一次性肌肉注射25 mg/kg諾氟沙星后，血淋巴和肌肉 T1/2α依次為1.66 h和0.08 h，T1/2β為1.69 h和4.42 h，T1/2Ka為 1.66 h 和 0.08 h，Tmax為 1.82 h 和 0.03 h，Cmax為 6.008 mg/L 和 16.72 mg/L[9]。說(shuō)明在青蝦中肌肉對(duì)諾氟沙星的吸收較血淋巴快，且在肌肉中殘留時(shí)間也較血淋巴長(zhǎng)，這與肌肉注射的給藥方式有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦血淋巴、肝胰腺和肌肉組織Tmax依次為1、4、4 h，結(jié)合藥時(shí)曲線，三者均在0.5～1 h內(nèi)急劇下降，血淋巴的藥時(shí)曲線在0.5～48 h內(nèi)整體呈下降趨勢(shì)，且在8 h后藥物濃度接近于零，而肝胰腺和肌肉的藥時(shí)曲線均在1～4 h緩慢上升并于4 h后開(kāi)始下降。肝胰腺中下降較為緩慢，在16 d后藥物殘留才降為零，而肌肉組織于8 h后降為零，這可能是由于蝦進(jìn)食后藥物最先進(jìn)入血淋巴，而后進(jìn)入肝胰腺和肌肉有關(guān)。血淋巴的藥時(shí)曲線整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)且在8 h后藥物接近于零，肝胰腺和肌肉的藥時(shí)曲線在1～4 h又出現(xiàn)一個(gè)上升的階段，這是藥物在組織中滯后于血淋巴并且與累積效應(yīng)有關(guān)；肝胰腺在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍能檢測(cè)到一定量的諾氟沙星，這與肝臟作為解毒器官，對(duì)藥物的蓄積有一定的關(guān)系。房文紅等[10]研究在兩種給藥方式下諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦血淋巴中的藥代動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)肌肉注射藥物和藥餌口服給藥條件下，前者藥物濃度表現(xiàn)為迅速上升，給藥后2min達(dá)到最高值，之后下降速度較快，而后者給藥后諾氟沙星濃度迅速上升至4 h達(dá)到最高，隨后下降又回升在12 h出現(xiàn)第二個(gè)藥峰，這與本實(shí)驗(yàn)諾氟沙星在肝胰腺和肌肉的藥時(shí)曲線趨勢(shì)基本一致，均在4 h出現(xiàn)峰值，這相當(dāng)于一次“自體給藥”過(guò)程。關(guān)于藥物吸收出現(xiàn)雙峰或多峰現(xiàn)象的研究在其他動(dòng)物已有研究[11]，本實(shí)驗(yàn)主要目的為研究諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的代謝消除時(shí)間，同時(shí)，為保證蝦有一定的攝食時(shí)間，故在0.5 h內(nèi)沒(méi)有設(shè)置取樣點(diǎn)，因此曲線無(wú)法呈現(xiàn)兩個(gè)完整峰。在實(shí)際藥殘檢測(cè)中，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)諾氟沙星在凡納濱對(duì)蝦血淋巴、肝胰腺和肌肉的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和藥時(shí)曲線，投喂過(guò)諾氟沙星的凡納濱對(duì)蝦至少應(yīng)經(jīng)過(guò)448℃.d后藥物才會(huì)消除。