史紅利

(嵩縣人民醫(yī)院腫瘤科，河南 嵩縣 471400)

卵巢上皮性腫瘤的發(fā)生早期缺乏可靠的篩查指標(biāo)，其早期診斷水平較低。流行病學(xué)研究顯示，卵巢癌的發(fā)病率可達(dá)233～566/10萬人左右[1]。臨床上卵巢癌的病情進(jìn)展，能夠?qū)е禄颊吲枨粌?nèi)器官轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的發(fā)生，病死率較高[2]。

在探討卵巢癌的發(fā)病病因的過程中發(fā)現(xiàn)，基因或者基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄反應(yīng)蛋白的分子表達(dá)水平的改變，能夠通過影響到癌細(xì)胞的生物學(xué)特征，進(jìn)而在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制癌細(xì)胞的凋亡等方面發(fā)揮作用。環(huán)氧合酶－2蛋白1（COX－2）能夠通過誘導(dǎo)局部腫瘤微環(huán)境中的氧化應(yīng)激損傷，促進(jìn)癌細(xì)胞的DNA擴(kuò)增風(fēng)險(xiǎn)，并能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子的激活，促進(jìn)新生血管的形成，并增加腫瘤病灶組織的血流灌注[3]；人激肽釋放酶－14（human kallikrein－14，hk14）能夠通過其結(jié)構(gòu)上的絲氨酸結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞膜表面糖蛋白受體的激活，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的激活，增加癌細(xì)胞的侵襲或者轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[4，5]。 為了進(jìn)一步揭示 hK14、COX－2 蛋白表達(dá)與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而為臨床上卵巢癌的早期篩查提供可靠的實(shí)驗(yàn)室參考指標(biāo)，本次研究選取我院確診的上皮性卵巢癌患者組織標(biāo)本100例，探討了相關(guān)指標(biāo)的異常表達(dá)變化，并揭示了其與卵巢癌臨床分期、細(xì)胞分化或者腹水等的關(guān)系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取我院手術(shù)后卵巢癌組織標(biāo)本100例（病灶組）、正常卵巢組織50例（對(duì)照組），收集時(shí)間2015年5月－2017年5月。病灶組，年齡29～65 歲，平均年齡 38．52±11．33 歲，良性卵巢漿液性腫瘤15例，交界性卵巢漿液性腫瘤20例，卵巢漿液性腫瘤65例。卵巢漿液性腫瘤65例中，病理分級(jí)G1級(jí)19例，G2級(jí)23例，G3級(jí)18例。臨床分期，I期18例，Ⅱ期14例，Ⅲ期15例，Ⅳ期18例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例，無轉(zhuǎn)移27例。有腹水40例，無腹水25例。對(duì)照組，年齡30～66歲，平均年齡 38．19±12．15 歲，兩組年齡沒有明顯差異 （P＞0．05）。

1．2 納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1．2．1 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴術(shù)前未合并其他部位惡性腫瘤；⑵術(shù)后病理證實(shí)為上皮性卵巢癌；⑶手術(shù)根治性切除腫瘤，術(shù)后生存期大于1個(gè)月，未發(fā)生圍術(shù)期并發(fā)癥；⑷有完整規(guī)范的術(shù)后病理報(bào)告及隨訪資料；⑸術(shù)前未接受放化療；⑹無高血壓、糖尿病、腎炎、急慢性盆腔炎及子宮內(nèi)膜異位癥等疾病，近期均未服影響前列腺素和血栓素代謝的藥物。

1．2．2 排除標(biāo)準(zhǔn) ⑴合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；⑵未能完成隨訪者；⑶貧血及凝血功能障礙；⑷風(fēng)濕及免疫系統(tǒng)疾??；⑸嚴(yán)重的肝腎功能疾??；⑹甲狀腺功能障礙；⑺因其他部位腫瘤進(jìn)行過放化療治療者。

1．3 免疫組化染色及蛋白質(zhì)免疫印跡方法 蛋白印記法檢測相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)：冰上分離出血腫周邊腦組織(假手術(shù)組為左側(cè)尾狀核)，置于預(yù)冷的研缽中液氮研磨至粉末狀。按總蛋白80g計(jì)算上樣體積，4：l的比例加上樣緩沖液，每條泳道加20ul樣品緩沖液，于60V電壓下跑膠，脫脂蛋白封閉2h，羊抗 hK14、COX－2 蛋白抗體(1：200)，2h 后加入二抗。Image proplus 4．01版本的專業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。

免疫組化檢測相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)：所有組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后作連續(xù)切片，厚度約為4mm，采用免疫組化鏈霉卵白素一生物素復(fù)合體法 (strep avidin－biotin complex，SABC 法)染色，二氨基聯(lián)苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。hK14、COX－2 抗體、PV6000通用型二抗以及SP試劑盒和DAB顯色盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)開發(fā)公司。以陽性片及PBS代替一抗分別作為陽性及陰性對(duì)照，高倍顯微鏡下觀察hK14、COX－2的表達(dá)情況，具體染色步驟嚴(yán)格按照SP試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1．4 免疫組化判定標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化結(jié)果判定：以呈現(xiàn)清晰的棕黃色顆粒為陽性，按陽性細(xì)胞所占比例數(shù)分為： 染色強(qiáng)度分為－(陰性)、+(弱)、++(中度)、+++(強(qiáng))； 染色范圍為－(0%～5%)、+(6%～25%)，++(26%～50%)、+++(﹥50%)。 兩種蛋白陽性表達(dá)結(jié)果中，(一)歸為陰性表達(dá)組，(+)、(++)、(+++)歸為陽性表達(dá)組。采用免疫印跡（Western blot）法測定各組織中 hK14、COX－2 蛋白表達(dá)水平（灰度值＞15．0 為陽性）。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 17．0，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料組間比較采用 χ2檢驗(yàn)；P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 兩組組織標(biāo)本中hK14、COX－2蛋白的表達(dá)情況比較 病灶組、對(duì)照組的hK14蛋白表達(dá)陽性率分別為 83．00%、8%（P＜0．001），表 1。病灶組、對(duì)照組的 COX－2蛋白表達(dá)陽性率分別為 78．00%、4．00%（P＜0．001），表 2。

表1 組織標(biāo)本中hK14蛋白表達(dá)情況比較

表2 組織標(biāo)本中COX-2蛋白表達(dá)情況比較

2．2 hK14、COX－2蛋白印跡檢測結(jié)果 交界性卵巢漿液性腫瘤、卵巢漿液性腫瘤、良性卵巢漿液性腫瘤 hK14 蛋白表達(dá)率分別為 65．00%、87．69%、33．33%，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0．05）；交界性卵巢漿液性腫瘤、卵巢漿液性腫瘤COX－2蛋白表達(dá)率分別為 80．00%、93．85%，與對(duì)照組相比具有顯著性差異（P＜0．05）；表 3。

2．3 卵巢癌組織標(biāo)本中的hK14、COX－2蛋白表達(dá)與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 COX－2蛋白表達(dá)率和相對(duì)含量在不同的年齡、臨床分期、病理分級(jí)、有無腹水及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間比較，均無顯著性差異 （P＞0．05），hK14 蛋白表達(dá)率和相對(duì)含量在臨床分期、病理分級(jí)、有無腹水及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間比較，均有顯著性差異（P＜0．05）。 表 4。

3 討論

卵巢癌的早期篩查主要通過血清學(xué)指標(biāo)進(jìn)行，雖然超聲或者CT等輔助檢查能夠在疾病的高危篩查、診斷及臨床預(yù)后過程中發(fā)揮重要的作用，但對(duì)于部分病變不典型、病灶范圍較小的卵巢腫瘤人群中，影像學(xué)檢查的局限性較為明顯。同時(shí)在卵巢惡性病變的早期，影像學(xué)檢查的靈敏度較低，其預(yù)測卵巢惡性腫瘤的總體風(fēng)險(xiǎn)不足25%[6]。血清學(xué)指標(biāo)的篩查具有微創(chuàng)、可反復(fù)測量，能夠在廣大基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及無相關(guān)高危因素的基礎(chǔ)人群中廣泛開展。但一項(xiàng)包含了345例樣本量的卵巢血清學(xué)指標(biāo)可見，現(xiàn)階段臨床上對(duì)于部分腫瘤如卵巢粘液性腫瘤或者印戒細(xì)胞癌等的評(píng)估價(jià)值較低[7]。本次研究通過對(duì)于新型相關(guān)腫瘤分子的分析研究，能夠?yàn)楹罄m(xù)臨床上腫瘤的血清學(xué)篩查提供新的選擇。

表3 hK14、COX-2蛋白表達(dá)水平比較

表4 上皮性卵巢癌hK14、COX-2蛋白表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

COX－2作為氧化應(yīng)激性指標(biāo)，其能夠在誘導(dǎo)下游IL－6或者IL－10等方面發(fā)揮作用，促進(jìn)卵巢上皮細(xì)胞的線粒體損傷，促進(jìn)癌細(xì)胞DNA增殖過程中調(diào)控障礙。COX－2對(duì)于癌細(xì)胞粘附能力的改變，能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞粘附淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)癌細(xì)胞通過局部組織液及淋巴液進(jìn)行擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)[8，9]。 已經(jīng)證實(shí)的是，COX－2 能夠促進(jìn)甲狀腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤的臨床分期的進(jìn)展，高表達(dá)的COX－2能夠加劇癌細(xì)胞的異型性，促進(jìn)組織學(xué)分級(jí)的惡化；hK14結(jié)構(gòu)上包含的絲氨酸結(jié)構(gòu)，能夠通過誘導(dǎo)下游脯氨酸酶的上調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)NTOCH或者M(jìn)APK信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)癌細(xì)胞內(nèi)的腫瘤相關(guān)基因cyc－m的上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞的生物學(xué)特征的改變[10，11]。部分研究揭示了hK14在影響到消化道腫瘤、呼吸系統(tǒng)腫瘤中的作用，但在卵巢上皮性腫瘤中的研究較少。

本次研究通過免疫組化及蛋白印記檢測分析發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌病灶組織中，可以發(fā)現(xiàn)顯著的hK14、COX－2蛋白的表達(dá)陽性率或者表達(dá)水平的上升，其表達(dá)水平明顯高于正常卵巢上皮組織，這提示hK14、COX－2二者均可能參與到了卵巢腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，從機(jī)制上分析hK14、COX－2蛋白的表達(dá)對(duì)于卵巢惡性腫瘤的病情影響主要與下列機(jī)制有關(guān)[12，13]：⑴hK14蛋白對(duì)于癌細(xì)胞內(nèi)的AKT或者M(jìn)APK等通路的激活作用，促進(jìn)了癌細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子a的異常轉(zhuǎn)錄，影響到了癌細(xì)胞的細(xì)胞異型性、分化成熟障礙等生物學(xué)特征；⑵COX－2蛋白在影響到腫瘤氧化應(yīng)激反應(yīng)的同時(shí)，能夠促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞或者樹突狀細(xì)胞的免疫抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的發(fā)生。孫麗麗等[14]研究者在探討了83例樣本量的卵巢腫瘤的分子譜表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，COX－2蛋白的表達(dá)陽性率可平均上升25%以上，在綜合性治療敏感性較低、治療后復(fù)發(fā)率較高或者生存預(yù)后較差的卵巢腫瘤患者中，COX－2蛋白表達(dá)陽性率可進(jìn)一步上升。交界性卵巢漿液性腫瘤、卵巢漿液性腫瘤等病灶組織中，均可以發(fā)現(xiàn)hK14、COX－2蛋白的高表達(dá)趨勢，同時(shí)在卵巢良性漿液性腫瘤中，同樣可以發(fā)現(xiàn)hK14的高表達(dá)趨勢，提示hK14不僅對(duì)于惡性腫瘤或者交界性腫瘤的發(fā)生具有一定的標(biāo)志作用，同時(shí)對(duì)于卵巢良性病變同樣具有一定潛在篩查價(jià)值。在探討相關(guān)因子表達(dá)與卵巢癌患者臨床病理特征關(guān)系過程中可以發(fā)現(xiàn)，hK14蛋白的表達(dá)能夠?qū)е侣殉舶┗颊吡馨徒Y(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，促進(jìn)臨床分期的進(jìn)展，同時(shí)對(duì)于卵巢腫瘤病灶的組織學(xué)分級(jí)等同樣具有一定的影響，這主要考慮與hK14蛋白對(duì)于淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子adherin 1的上調(diào)作用，或者與其對(duì)于癌細(xì)胞浸潤能力的增加，從而促進(jìn)臨床分期進(jìn)展有關(guān)。但本次研究并未發(fā)現(xiàn)COX-2蛋白的表達(dá)與卵巢腫瘤的臨床病理特征的關(guān)系，考慮COX-2蛋白可能主要參與到了卵巢腫瘤的早期發(fā)生過程，而對(duì)于病情進(jìn)展無特異性的促進(jìn)作用[15]。

綜上所述，hK14、COX-2蛋白在上皮性卵巢癌組織中高表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，有望成為治療卵巢癌的靶點(diǎn)。