閔文光，余慧宏，魏建萍，涂智杰，吳建英，宋建新

(景德鎮(zhèn)市疾病預防控制中心，江西 景德鎮(zhèn) 333000)

微生物引起的食源性疾病中，志賀菌，大腸埃希菌O157與副溶血性弧菌引起的食源性疾病占據(jù)了大多數(shù)。傳統(tǒng)檢測方法的操作步驟過于繁瑣，工作量大，檢測周期長，不能及時為食源性疾病爆發(fā)和食物中毒提供有效的線索[5]。本研究旨在建立一種快速同時檢測三種病原菌的多重PCR方法。有文獻報道，志賀菌侵襲性質(zhì)?？乖璈的IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]，大腸埃希菌O157的eaeA基因[3，4]均具有很高的特異性，在這些文獻研究中已得到驗證。通過對三種致病菌的基因進行分析，設計出各自特異性PCR引物，通過對病原學標本的合理處理，PCR反應條件的摸索，能同時對三種病原菌進行PCR擴增。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株實驗所用菌株共8株，分別為志賀菌(ATCC10412)、大腸埃希菌 O157(ATCC43888)、腸道致病性大腸埃希氏菌(ATCC11775)、產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌 (ATCC35401)、 金黃色葡萄球菌(ATCC29213)、單核細胞增生李斯特菌(CMCC54004)、蠟樣芽孢桿菌(CMCC(B)63303)、副溶血性弧菌（ATCC17802）。所有菌株均為本實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基LB培養(yǎng)液組成成份 胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、酵母提取物 5g/L，用 40g/LNaOH 調(diào)pH至7.0。

1.1.3 試劑及儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP、Mg-Cl2、10×PCR buffer購于上海生工；引物由上海生工合成；DL2000DNA Marker、溴化乙錠購于大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖為西班牙Biowest公司產(chǎn)品。PTC-200PCR儀為美國MJ公司產(chǎn)品；LEGEND MICRO 21Centrifuge高速離心機為美國Thermo Scientific公司生產(chǎn)；FLY-211B恒溫搖床；DYY-6C電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)；GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)志賀菌侵襲性質(zhì)?？乖璈的IpaH基因[1]、副溶血性弧菌t1基因[2]，大腸埃希菌 O157 的 eaeA 基因[3，4]設計 3 對引物（表 1）。本實驗提取3種菌株核酸為模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物進行電泳鑒定。

1.2.2 DNA模板的制備 將8株保藏菌株按照不同組合方式接種于5mlLB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，取菌液150μl于離心管中，12000r/min離心12min后棄上清，收集菌體，加1ml生理鹽水洗滌1次，然后以100μl生理鹽水懸浮菌體，沸水浴加熱5min，迅速冷卻后，12000r/min離心5min，上清即為DNA模板[6]。

1.2.3 大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌單獨PCR擴增實驗 以表1中3對引物分別對3株目的菌的DNA進行PCR擴增驗證引物的有效性，PCR 反應條件：94℃預變性 5min；94℃變性 30s，55℃退火 30s，72℃延伸 30s，進行 35 個循環(huán)；最后72℃延伸 5min。PCR 反應體系 （20ul）：Mg2+濃度2.0mmol/L，10 ×PCR Buffer：2μl，2.5mmol/L dNTPs 2μl，5U/μl Taq DNA 聚合酶 0.4μl，20umol/L 引物2μl，DNA 模板 2μl，加 ddH2O 補足到 20μl[6]。 PCR產(chǎn)物檢測：各取5μl PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，以DL2000Marker作參照，在2%瓊脂糖凝膠 （含EB 0.5μg/ml）中，200V電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.2.4 引物特異性實驗 以表1中3對引物分別對8株實驗菌株的DNA進行PCR擴增以驗證引物的特異性[6]，PCR檢測方法同1.2.3中所述[6]。

1.2.5 多重PCR檢測LB培養(yǎng)液中多種病原菌將志賀菌、副溶血性弧菌、大腸埃希菌O157分別、同時與其他5種病原菌 （包括腸道致病性大腸埃希菌，產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特菌，蠟樣芽孢桿菌）接種于LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)[7]，所有細菌接種量為5cfu/ml，用上述PCR方法檢測。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌單獨PCR擴增 采用LB培養(yǎng)液增菌后，提取3種目的菌DNA，對三種目的菌分別進行PCR擴增，（圖1）。

圖1 大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌單獨PCR擴增結(jié)果

由圖1可知，在LB培養(yǎng)液中增菌的大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌均能擴增出條帶，其中大腸埃希菌O157和志賀菌的擴增效果較好，副溶血性弧菌的擴增條帶較弱，可以加大DNA模板量增強擴增效果。

2.2 引物特異性實驗 用表1中的3對引物對8株實驗菌株進行PCR擴增，分析引物的特異性，結(jié)果表明，3對引物只能擴增目標基因，不會擴增非目的基因，特異性良好。

表1 志賀菌、大腸埃希菌O157、副溶血性弧菌多重PCR反應引物序列

表2 引物特異性實驗結(jié)果

2.3 多重PCR檢測LB培養(yǎng)中多種病原菌 將大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌，干擾菌(金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特菌，蠟樣芽孢桿菌，腸道致病性大腸埃希菌，產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌)分別或同時接種到LB培養(yǎng)液中37℃振蕩培養(yǎng)10h進行增菌[8]。實驗重復3次，提取DNA進行多重PCR檢測。

圖2 接種LB培養(yǎng)液的待測菌多重PCR結(jié)果

1，4 為大腸埃希菌O157和其他干擾菌，2為副溶血性弧菌和其他干擾菌，3為志賀菌和其他干擾菌，5為大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌和5種干擾菌

從圖2可以看出，接種5cfu/ml大腸埃希菌O157和其他干擾菌僅擴增出384bp的特異性條帶；接種5cfu/ml副溶血性弧菌和其他干擾菌僅擴增出449bp的特異性條帶；接種5cfu/ml志賀菌和其他干擾菌僅擴增出589bp的特異性條帶；同時接種平均5cfu/ml大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌和其他干擾菌后，在泳道上只有3條特異性條帶，而沒有其他條帶，表明多重PCR有良好的特異性。

3 討論

本研究根據(jù)志賀菌IpaH基因、副溶血性弧菌t1基因、大腸埃希菌O157 eaeA基因設計特異性引物，為了驗證引物的特異性，在實驗中加入腸道致病性大腸埃希菌，產(chǎn)腸毒素性大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，單核細胞增生李斯特菌，蠟樣芽孢桿菌5種干擾菌，通過PCR擴增反應，結(jié)果得出，設計的引物有很好的特異性，同時根據(jù)參考文獻，優(yōu)化PCR條件，建立一種同時檢測大腸埃希菌O157，志賀菌，副溶血性弧菌的多重PCR檢測方法。使用LB增菌液同時培養(yǎng)大腸埃希菌O157，志賀菌和副溶血性弧菌，能通過多重PCR反應檢測出來[9，10]。使用一種培養(yǎng)液同時培養(yǎng)3中致病菌，大大減少了增菌和模板提取的工作量，提高了檢測效率。有報道稱直接從樣本中直接富集菌體進行PCR，這對樣本要求較高，容易導致漏檢，增菌后檢測能顯著提高陽性檢出率。