呂嬌鳳，劉靜，王小中，應(yīng)后群，葉雙

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006)

唾液酸化糖鏈抗原 （Kerbs von den Lungen－6 antigen，KL－6）是分類于第 9 族肺細(xì)胞抗原，相對(duì)分子質(zhì)量約200000的糖蛋白。主要表達(dá)在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞，在正常肺組織和終末細(xì)支氣管上皮細(xì)胞只有極少量表達(dá)，而在肺泡I型上皮細(xì)胞上不表達(dá)。KL－6在間質(zhì)性肺疾病患者中此項(xiàng)指標(biāo)較健康人和其他呼吸系統(tǒng)疾病患者顯示出有意義的升高，其表達(dá)異常與肺間質(zhì)疾病密切相關(guān)，是一類新發(fā)現(xiàn)的肺間質(zhì)性疾病的生物標(biāo)志物[1]。目前KL－6檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)或者電化學(xué)發(fā)光法[2－4]，ELISA法操作相對(duì)繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，電化學(xué)發(fā)光法需要特殊儀器且成本較高。近年來(lái)出現(xiàn)在生化分析儀上利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法（LEIA）測(cè)定KL－6，為此本研究擬建立我科全自動(dòng)生化分析儀AU5421上定量檢測(cè)KL－6的方法，并對(duì)其進(jìn)行方法學(xué)評(píng)價(jià)，以探討其是否適合臨床應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器 LEIA法所用儀器為Beckman coulter AU5421全自動(dòng)生化分析儀，化學(xué)發(fā)光法所用儀器為L(zhǎng)UMIPULSE G1200全自動(dòng)免疫分析儀。

1.1.2 試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品 方法學(xué)評(píng)價(jià)所用試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品均由積水醫(yī)療科技（中國(guó)）有限公司提供，質(zhì)控品Ⅰ和質(zhì)控Ⅱ （批號(hào)：5405D），LEIA法所用試劑（批號(hào)：906RDM）、校準(zhǔn)品（批號(hào)：827REM）；化學(xué)發(fā)光法所用試劑、校準(zhǔn)品均為富士瑞必歐株式會(huì)社生產(chǎn)，試劑（批號(hào)：FTX6041）、校準(zhǔn)品（批號(hào)：FYX6051）。

1.2 檢測(cè)原理 將包被鼠抗人KL-6單克隆抗體致敏膠乳顆粒與待檢標(biāo)本混合，標(biāo)本中的KL-6與膠乳顆粒表面抗體結(jié)合，發(fā)生凝集反應(yīng)產(chǎn)生濁度。濁度的增加與標(biāo)本中KL-6含量成一定比例關(guān)系，與相同條件下操作的標(biāo)準(zhǔn)品比較，通過(guò)劑量/反應(yīng)曲線求出標(biāo)本中KL-6的含量。

1.3 主要檢測(cè)參數(shù) 樣本體積為2.5μl，試劑1（R1）為 150μl，試劑 2（R2）為 50μl，采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法，反應(yīng)方向?yàn)橄蛏戏磻?yīng)，主波長(zhǎng)570nm，副波長(zhǎng)為800nm，反應(yīng)溫度為37℃，讀點(diǎn)時(shí)間：12點(diǎn)/27點(diǎn)。

1.4 方法

1.4.1 精密度[5-6]批內(nèi)精密度：選擇兩個(gè)水平的質(zhì)控血清作為評(píng)價(jià)樣本，在較短的時(shí)間內(nèi)及穩(wěn)定的條件下連續(xù)重復(fù)測(cè)定20次，記錄每次的測(cè)定結(jié)果并計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)（CV）；日間精密度：每天測(cè)定1次評(píng)價(jià)樣本，累積20次結(jié)果，計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和CV。

1.4.2 回收實(shí)驗(yàn) 參考CLSI EP15-A[7]文件，選擇無(wú)溶血、黃疸、脂血的新鮮患者血清制備1份混合血清作為基線標(biāo)本，重復(fù)測(cè)定3次求平均值作為基線值，將混合基線標(biāo)本分成5份，每份0.9ml，分別加入 0、25、50、75、100μl KL-6 高值校準(zhǔn)品(2500U/ml)，再分別加入 100、75、50、25、0μl生理鹽水，分別混勻成每份1.00ml的標(biāo)本在全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算平均值作為每份標(biāo)本的測(cè)定值，減去基礎(chǔ)管測(cè)定值確定回收量。回收率(%)=回收量/加入濃度×100。

1.4.3 線性范圍 按照參考文獻(xiàn)[8]，以5000U/ml的校準(zhǔn)液作為高值樣本（H），50U/ml的無(wú)溶血、黃疸、脂血的新鮮血清標(biāo)本作為低值樣本（L），分別按照5H、4H+1L、3H+2L、2H+3L、1H+4L、5L 的關(guān)系配置成6個(gè)濃度梯度樣本，每個(gè)濃度的樣本按順序測(cè)定三次，計(jì)算均值，將實(shí)測(cè)均值與理論值作比較（偏離應(yīng)小于 10%）[9]，將理論值(x)與實(shí)測(cè)均值(y)進(jìn)行回歸分析，得到直線回歸方程y=bx+a。若b值在1±0.03范圍，相關(guān)系數(shù)r2≥0.975，a和0無(wú)顯著差異，接近于0，則可直接判斷分析測(cè)量范圍在實(shí)驗(yàn)已涉及濃度；如果上述任一條不滿足條件，則舍去高值或低值組數(shù)據(jù)，再做回歸統(tǒng)計(jì)分析，直至縮小分析范圍或重做，判斷符合要求。

1.4.4 方法學(xué)比較 參照CLSI EP9-A2文件要求，選擇40份臨床血清樣本，濃度覆蓋線性范圍，參考區(qū)間內(nèi)及超出參考區(qū)間上下限的標(biāo)本各約一半，每天8份樣本，將每份標(biāo)本分別采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法和化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行雙份測(cè)定，按1→8測(cè)定，第2次按8→1順序測(cè)定，且在4h內(nèi)完成，連續(xù)5d。將兩種方法測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，若顯著相關(guān)，計(jì)算其回歸方程及兩種檢測(cè)方法間的偏倚。

1.4.5 試劑開瓶穩(wěn)定性 將高、低值的兩份無(wú)溶血、黃疸、脂血的新鮮血清標(biāo)本分別分裝30份，于-80℃冷凍保存?zhèn)溆茫瑱z測(cè)前從冰箱取出恢復(fù)至室溫混勻。在全自動(dòng)生化儀AU5421的1單元相應(yīng)的試劑倉(cāng)內(nèi)裝載R1與R2試劑，在儀器試劑倉(cāng)允許溫度范圍內(nèi)開蓋放置，當(dāng)天做完校準(zhǔn)后不再更換試劑和校準(zhǔn)，每天測(cè)定質(zhì)控合格后測(cè)定高、低值血清標(biāo)本各1份，分別重復(fù)3次，計(jì)算均值及相對(duì)偏差。以相對(duì)偏差＜±10%作為該試劑穩(wěn)定性的判斷限[10]。

1.4.6 干擾實(shí)驗(yàn) 參考CLSI EP7-A2[11]和相關(guān)文獻(xiàn)[12，13]，選擇 KL-6 濃度分別為 500U/ml（高值）、100U/ml（低值）的兩份無(wú)溶血、黃疸、脂血的新鮮血清標(biāo)本，取干擾物（膽紅素、血紅蛋白和脂肪乳）和生理鹽水分別與高值血清標(biāo)本按1：9比例混合為標(biāo)本A、 標(biāo)本 B，A 與 B 按 3：0、2：1、1：2、0：3 比例混合為4份待測(cè)標(biāo)本，每份標(biāo)本重復(fù)測(cè)三次。用同樣方法做低值血清的干擾實(shí)驗(yàn)。將每份標(biāo)本各組的均值減去未加干擾物相應(yīng)組的均值即可得出干擾值，并計(jì)數(shù)出干擾率，以相對(duì)偏差＜10%作為該檢測(cè)方法對(duì)干擾物的判斷限，在范圍內(nèi)判斷為無(wú)明顯干擾，否則為有明顯干擾。干擾率(%)=干擾值/基礎(chǔ)值×100%。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用Excel 2007辦公軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用直線回歸方程。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 LEIA法測(cè)定質(zhì)控品水平Ⅰ和水平Ⅱ的批內(nèi)CV分別為2.63%、2.60%，日間CV分別為4.07%、3.13%，均低于試劑廠家聲明的不精密度（10%）。結(jié)果見表1。

2.2 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基線標(biāo)本的新鮮混合血清的平均值為100U/ml，KL-6校準(zhǔn)品濃度為2500U/ml，計(jì)算平均回收率為100.4%，符合臨床應(yīng)用要求。結(jié)果見表2。

2.3 線性范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果 6個(gè)濃度梯度樣本，按實(shí)驗(yàn)方法測(cè)量，記錄結(jié)果并繪制散點(diǎn)圖，所有實(shí)驗(yàn)點(diǎn)呈明顯直線趨勢(shì)，建立直線回歸方程，y=0.9923 x-0.0776，r2=0.9981，截距 a與 0均無(wú)顯著性差異（P＞0.05），且6個(gè)實(shí)測(cè)均值與預(yù)期值偏差均＜±10%，該方法線性范圍為（50～5000）U/ml。 結(jié)果見圖 1。

圖1 免疫比濁法測(cè)定KL-6線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 LEIA法測(cè)定血清KL-6精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 LEIA法測(cè)定血清KL-6回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 采用LEIA法和化學(xué)發(fā)光法分別測(cè)定40份標(biāo)本，以化學(xué)發(fā)光法結(jié)果為X軸、LEIA法測(cè)定結(jié)果為Y軸，進(jìn)行相關(guān)性分析，回歸方程為 y=0.9581 x+14.3206，r2=0.9989，P＜0.01，結(jié)果顯示，兩法相關(guān)性良好，在醫(yī)學(xué)決定水平105U/ml與500U/ml處的偏倚均＜1/2Tea(10%)。結(jié)果見圖2。

2.5 試劑開瓶穩(wěn)定性結(jié)果 每天分別用兩份不同濃度血清測(cè)定結(jié)果平均值與第1d測(cè)定結(jié)果的平均值計(jì)算相對(duì)偏倚，29d內(nèi)均＜±10%，試劑開瓶后處于儀器試劑倉(cāng)冷藏保存可穩(wěn)定29d。結(jié)果見表3。

2.6 干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 膽紅素≤200mg/L、血紅蛋白≤6g/L、脂肪乳≤5%時(shí)對(duì)KL-6的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯干擾。結(jié)果見表4～表6。

3 討論

KL-6是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞膜上的一種糖蛋白，可從Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞上脫落進(jìn)入肺泡腔和血液。血清KL-6水平用于診斷間質(zhì)性肺疾病具有較高的敏感性和特異性，且與病情嚴(yán)重度及臨床療效相關(guān)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值[14]。

表3 LEIA法測(cè)定血清KL-6試劑開瓶穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 兩種檢測(cè)方法相關(guān)性分析

表4 不同濃度膽紅素對(duì)LEIA法測(cè)定血清KL-6干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 不同濃度血紅蛋白對(duì)LEIA法測(cè)定血清KL-6干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表6 不同濃度脂肪乳對(duì)LEIA法測(cè)定血清KL-6干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

ELISA法是臨床實(shí)驗(yàn)室KL-6檢測(cè)常用的方法，ELISA法操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，受人為因素影響較大、自動(dòng)化程度不高，難以滿足臨床大批量標(biāo)本的檢測(cè)等?；瘜W(xué)發(fā)光測(cè)定法近年來(lái)也逐漸被用于臨床分析，被認(rèn)為目前較為準(zhǔn)確的方法，靈敏度雖高，但其檢測(cè)線性范圍較小，一般都是封閉的檢測(cè)系統(tǒng)，需要特定配套的儀器和試劑盒，檢測(cè)成本高，難以在臨床上大范圍普及使用[15]。這些原因?qū)е翶L-6的應(yīng)用范圍較小，難以在臨床上普及應(yīng)用。本研究在全自動(dòng)生化分析儀上，建立LEIA法對(duì)血清KL-6進(jìn)行檢測(cè)，參照CLSI系列文件及有關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。表1結(jié)果顯示該方法批內(nèi)CV分別為2.63%、2.60%，日間CV分別為4.07%、3.13%，均低于試劑廠家聲明的不精密度（10%），精密度好滿足臨床要求；準(zhǔn)確性高，回收實(shí)驗(yàn)表明平均回收率可達(dá)100.4%；用病人新鮮血清與化學(xué)發(fā)光法作方法學(xué)比較，r2=0.9989，兩法結(jié)果具有良好的相關(guān)性；通過(guò)干擾實(shí)驗(yàn)顯示膽紅素≤200mg/L、血紅蛋白≤6g/L、脂肪乳≤5%時(shí)對(duì)KL-6的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯干擾；該方法的線性范圍寬，線性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明線性可達(dá)5000U/ml；試劑開瓶后在儀器試劑倉(cāng)規(guī)定溫度內(nèi)穩(wěn)定期長(zhǎng)，可穩(wěn)定29d，對(duì)于樣本量少時(shí)試劑可以使用更長(zhǎng)時(shí)間，節(jié)約成本。

綜上所述，免疫比濁法測(cè)定血清KL-6操作簡(jiǎn)便、快速，準(zhǔn)確度和精密度高，線性范圍寬，具有較強(qiáng)的抗干擾能力，試劑在線穩(wěn)定期長(zhǎng)，可在自動(dòng)生物分析儀上檢測(cè)，能夠滿足臨床需要，適合單個(gè)標(biāo)本檢測(cè)同時(shí)也可做大批量標(biāo)本檢測(cè)分析。