夏伯姍， 王振磊， 李岱慶， 王 曼， 王鴻芡， 張 梅，秦永平， 南 峰， 向 瑾

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137; 2. 四川大學(xué)華西醫(yī)院國家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)臨床藥理研究室，四川 成都 610041;3. 揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)四川海蓉藥業(yè)有限公司，四川 成都 610041)

0 引 言

氯沙坦鉀（losartan potassium）是全球第一個(gè)上市的口服非肽類血管緊張素II受體拮抗藥，可以阻斷內(nèi)源性及外源性的血管緊張素所產(chǎn)生的各種藥理作用，具有良好的抗高血壓療效。氯沙坦鉀口服吸收良好，經(jīng)首過代謝后形成羧酸型活性代謝物及其他無活性代謝物[1]。主要活性代謝物氯沙坦羧酸（losartan carboxylic acid，LCA）的降壓作用為氯沙坦（losartan，LST）的10倍[2]，因此在研究氯沙坦生物等效性和藥代動(dòng)力學(xué)時(shí)，同時(shí)測(cè)定氯沙坦和氯沙坦羧酸十分必要。同時(shí)，已有文獻(xiàn)報(bào)道氯沙坦鉀的藥動(dòng)學(xué)受不同代謝酶基因多樣性的影響[3-4]，有必要積累更多的樣本數(shù)據(jù)并對(duì)不同來源制劑進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)以獲得更多臨床藥物應(yīng)用的可靠信息。目前，國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道測(cè)定氯沙坦及其代謝物濃度的主要方法有LC-UV法[5-7]和LC-MS法，其中LC-MS法又包括HPLC-MS法[8]、HPLC-MS/MS[9-18]法以及UPLC-MS/MS法[19-20]，血漿樣品預(yù)處理方法有液液萃取法[5-13]、固相萃取法[14]和沉淀蛋白法[15-20]。但目前報(bào)道的方法往往難以兼顧樣本前處理的簡便快速、進(jìn)樣分析時(shí)間短、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好的高通量分析。本研究在以上方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，采用同位素標(biāo)記的藥物和代謝物作內(nèi)標(biāo)，乙腈沉淀蛋白后甲酸水溶液稀釋進(jìn)樣，建立了UPLC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中LST及其代謝物L(fēng)CA濃度方法。該方法血漿用量少，線性范圍廣，單個(gè)樣本分析時(shí)間僅為2.1 min，每日可檢測(cè)樣本數(shù)高達(dá)600個(gè)，可顯著提高分析人員的工作效率，適用于高通量的分析檢測(cè)工作，已成功用于氯沙坦鉀片（0.1 g）在健康志愿者的生物等效性研究。

1 材料與方法

1.1 方法

日本SHIMADZU SIL-30 AC型高效液相色譜儀；美國AB Sciex QTRAP 5500質(zhì)譜儀；德國Eppendorf公司5810R低溫離心機(jī)；美國Millipore公司Milli-Q型純水儀；法國METTLER TOLEDO公司XP205R型十萬分之一電子分析天平；昆山市超聲儀器有限公司KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器；數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)為Analyst 1.6.3。

1.2 藥品與試劑

line-height:16.3ptLST標(biāo)準(zhǔn)品，中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)100597-201102，純度99.9%；LCA標(biāo)準(zhǔn)品，加拿大Tlcpharmachem公司，批號(hào)1357-039A9，純度99.9%；d4-LST（d4-氯沙坦，d4-losartan）標(biāo)準(zhǔn)品，加拿大Tlcpharmachem公司，2286-087A3，純度98.6%；d4-LCA（d4-氯沙坦羧酸，d4-losartan carboxylic acid）標(biāo)準(zhǔn)品，加拿大Tlcpharmachem公司，批號(hào)2286-096，純度98.3%。乙腈、甲酸，美國Thermo Fisher公司，色譜純；氨水，成都科隆公司，分析純；超純水，美國Millipore公司Millipore型超純水器自制。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：SepaxGP-C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），美國SEPAX公司；柱溫：40℃；流動(dòng)相：A相為0.15%甲酸-0.04%氨水-水（超聲20 min后，加入0.01% 氨水），B相為0.15%甲酸-0.04%氨水-98%乙腈；梯度洗脫：0.01～0.60 min，B相48%～78%；0.60～0.90 min，B相78%～95%；0.90～0.95 min，B相95%～100%；0.95～1.50 min，B相保持100%不變；1.50～1.51 min，B相100%～48%；1.51～2.1 min，B相保持48%不變。流量：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：6 μL，進(jìn)樣時(shí)長：2.1 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)（MRM，multiple reaction monitoring），正離子模式掃描，ESI（電噴霧離子源，electron spray ionization），氣簾氣 35 psi（1 psi =6.895 kPa），霧化氣 40 psi，加熱輔助氣 60 psi，離子源溫度 500 ℃，噴霧電壓 5 500 V，去簇電壓 120 V，射入電壓 14 V，碰撞室射出電壓 13 V。LST、d4-LST的檢測(cè)離子對(duì)分別為（m/z）423.1→207.1、427.2→211.2，碰撞能量 18 V；LCA、d4-LCA的檢測(cè)離子對(duì)分別為（m/z）437.1→235.2、441.2→239.2，碰撞能量 23 V。

1.3.3 溶液的配制

LST、LCA標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液及工作液配制：精密稱取LST標(biāo)準(zhǔn)品10.18 mg（相當(dāng)于LST 10 mg）、LCA標(biāo)準(zhǔn)品10.22 mg（相當(dāng)于LCA 10 mg），分別置于兩個(gè)50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，獲得質(zhì)量濃度均為200 μg/mL的LST、LCA標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液，并用純化水配制成LST為40.0，80.0，400，2 000，8 000，20 000，36 000，40 000 ng/mL，LCA為48.0，96.0，480，2 400，9 600，24 000，43 200，48 000 ng/mL的LST-LCA標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液。置–35℃冰箱保存?zhèn)溆?。LST、LCA質(zhì)控儲(chǔ)備液及工作液配制：精密稱取LST標(biāo)準(zhǔn)品10.24 mg（相當(dāng)于LST 10 mg）、LCA標(biāo)準(zhǔn)品10.80 mg（相當(dāng)于LCA 10 mg），分別置于兩個(gè)50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，獲得質(zhì)量濃度均為200 μg/mL的LST、LCA質(zhì)控儲(chǔ)備液，并用純化水配制成LST為40.0，120，3 200，32 000 ng/mL，LCA為48.0，144，3 840，38 400 ng/mL的LST-LCA質(zhì)控工作液。置–35℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

內(nèi)標(biāo)d4-LST、d4-LCA儲(chǔ)備液及工作液的配制：取d4-LST 1 mg（1個(gè)包裝）置于10 mL容量瓶中，取d4-LCA標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（1個(gè)包裝）置于50 mL容量瓶中，分別用甲醇溶解并定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為100 μg/mL的d4-LST儲(chǔ)備液、質(zhì)量濃度為200 μg/mL的d4-LCA儲(chǔ)備液；置–35℃冰箱保存?zhèn)溆?。取d4-LST儲(chǔ)備液0.2 mL，d4-LCA儲(chǔ)備液0.125 mL，加入9.675 mL乙腈，獲得質(zhì)量濃度為d4-LST-2 000 ng/mL和d4-LCA-2 500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)中間工作液，再用乙腈將其稀釋成質(zhì)量濃度為d4-LST-20 ng/mL 和d4-LCA-25 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。配置好的溶液置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 樣品處理

取待測(cè)血漿樣品50 μL，加入150 μL內(nèi)標(biāo)工作液（d4-LST-20 ng/mL+d4-LCA-25 ng/mL），混勻30 s，低溫離心5 min（13 000 r/min，8℃），取上清液100 μL，加稀釋劑1%甲酸水50 μL，混合均勻，進(jìn)樣6 μL。

1.3.5 專屬性

取6個(gè)來源的空白血漿樣本、標(biāo)準(zhǔn)曲線最低管血漿樣本，除空白血漿以乙腈代替內(nèi)標(biāo)工作液外，其余均按1.3.4項(xiàng)下操作考察LST和LCA的專屬性。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將LST-LCA標(biāo)準(zhǔn)曲線系列工作液加入空白血漿中，得LST質(zhì)量濃度為2.00，4.00，20.0，100，400，1 000，1 800，2 000 ng/mL，LCA質(zhì)量濃度為2.40，4.80，24.0，120，480，1 200，2 160，2 400 ng/mL的LST-LCA血樣。按1.3.4項(xiàng)下處理后進(jìn)樣分析，以待測(cè)物質(zhì)量濃度x為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得LST、LCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線，權(quán)重系數(shù)為1/c2。

1.3.7 定量下限

以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低非零濃度點(diǎn)作為定量下限，配制濃度相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低管，即LST血漿濃度為2.00 ng/mL、LCA血漿濃度為2.40 ng/mL的樣品，按1.3.4項(xiàng)下處理，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定其濃度，計(jì)算其精密度與準(zhǔn)確度。

1.3.8 基質(zhì)效應(yīng)

以純水為溶劑，配制LST質(zhì)量濃度為3.00 ng/mL、LCA質(zhì)量濃度為3.60 ng/mL的低濃度基質(zhì)效應(yīng)工作液與LST質(zhì)量濃度為800 ng/mL、LCA質(zhì)量濃度為960 ng/mL的高濃度基質(zhì)效應(yīng)工作液。取6個(gè)不同來源的空白血漿作為血漿基質(zhì)，每一空白血漿6份（低、高濃度各3份），再取純化水6份作為對(duì)照基質(zhì)，除稀釋劑1%甲酸水以相應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)工作液代替外，其余均按1.3.4項(xiàng)下處理，獲得LST、LCA和內(nèi)標(biāo)d4-LST、d4-LCA峰面積，根據(jù)每一濃度樣本2種基質(zhì)中的峰面積比值計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。此外，配制脂血血漿（20%脂肪乳:空白血漿=1:9）、溶血血漿（凍融后全血:空白血漿=2:98），按以上相同方法考察脂血、溶血基質(zhì)效應(yīng)。

1.3.9 精密度與準(zhǔn)確度

取用質(zhì)控工作液加空白血漿配制的高、中、低、定量下限4個(gè)濃度質(zhì)控血漿樣本，每個(gè)濃度6份，按1.3.4項(xiàng)下操作，測(cè)定3批，根據(jù)每批隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算每個(gè)樣品的實(shí)測(cè)濃度，并分析計(jì)算批內(nèi)、批間精密度和準(zhǔn)確度。根據(jù)SFDN《生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》，分析方法的精密度為測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（變異系數(shù)），準(zhǔn)確度為該方法測(cè)得值與分析物標(biāo)示濃度的接近程度，表示為（測(cè)得值/真實(shí)值）×100%。

1.3.10 提取回收率

制備高、中、低3個(gè)濃度質(zhì)控血漿樣本，每個(gè)濃度3份，按1.3.4項(xiàng)下操作，以其進(jìn)樣得到的峰面積除以空白血漿經(jīng)蛋白沉淀后，直接加入相應(yīng)基質(zhì)效應(yīng)工作液后進(jìn)樣得到的峰面積，計(jì)算血漿中LST、LCA及內(nèi)標(biāo)d4-LST、d4-LCA的提取回收率。

1.3.11 穩(wěn)定性

以純化水為溶劑，將相應(yīng)儲(chǔ)備液、工作液配制成與標(biāo)準(zhǔn)曲線最高管進(jìn)樣濃度一致的穩(wěn)定性考察工作液，分別進(jìn)樣3次以考察儲(chǔ)備液、工作液短期保存穩(wěn)定性（室溫下保存22 h），儲(chǔ)備液長期保存穩(wěn)定性（–35℃冰凍保存117 d），工作液長期保存穩(wěn)定性（–35℃冰凍保存71 d）。

制備高、低2個(gè)濃度質(zhì)控血漿樣本，各21份，按1.3.4項(xiàng)下操作，記錄色譜峰面積，由當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度，與未放置、儲(chǔ)存樣本比較，分別考察反復(fù)凍融穩(wěn)定性：–35 ℃反復(fù)凍融5次；室溫放置穩(wěn)定性：血漿樣本室溫（19.5℃）下放置8 h；上清液放置穩(wěn)定性：血漿樣本沉淀離心后，上清液室溫放置30 h；進(jìn)樣室放置穩(wěn)定性：待測(cè)樣品于自動(dòng)進(jìn)樣器（8℃）放置16 h后進(jìn)樣；重復(fù)進(jìn)樣穩(wěn)定性：制備完成后的樣品重復(fù)進(jìn)樣3次；長期保存穩(wěn)定性：–35℃、–80℃冰凍保存71 d；全血放置穩(wěn)定性：全血樣本在室溫條件下放置6 h。

2 結(jié) 果

2.1 專屬性

空白血漿按1.3.4項(xiàng)下操作進(jìn)樣，得色譜圖見圖1（a），其本底值均低于300 cps，LST、LCA及其內(nèi)標(biāo)均無響應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低管血漿樣本按1.3.4項(xiàng)下操作進(jìn)樣后得色譜圖見圖1（b），LST及內(nèi)標(biāo)d4-LST的保留時(shí)間為1.16 min，LCA及內(nèi)標(biāo)d4-LCA的保留時(shí)間為1.26 min?？瞻籽獫{中在LST、LCA保留時(shí)間處出峰面積均小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低管血漿樣本的20%，對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)出峰位置均小于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低管血樣的1%，兩組色譜圖對(duì)比可知空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾LST和LCA的測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以待測(cè)物濃度x為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸得LST、LCA的標(biāo)準(zhǔn)曲線：LST：y=0.022 0x+0.005 53（r=0.999 2），LCA：y=0.012 4x+0.001 94（r=0.999 3），權(quán)重系數(shù)為1/c2（見圖2）。LST在2.00～2 000 ng/mL、LCA在2.40～2 400 ng/mL范圍標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。

2.3 定量下限

標(biāo)準(zhǔn)曲線最低管濃度即定量下限，LST的血漿濃度為2.00 ng/mL，LCA血漿濃度為2.40 ng/mL。定量下限的考察結(jié)果中，LST的準(zhǔn)確度為105.8%±0.1%，精密度（RSD）為3.8%，LCA的準(zhǔn)確度為105.2%±0.1%，精密度（RSD）為5.4%。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

通過內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，血漿基質(zhì)LST的低、高濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為102.8%±3.8%、101.8%±0.9%，其RSD為3.7%、0.8%，LCA的低、高濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為101.5%±2.7%、101.7%±0.4%，其RSD為2.7%、0.4%；溶血、脂血基質(zhì)LST的低、高濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為102.5%±0.4%、101.8%±0.3%，其RSD為0.4%、0.3%，LCA的低、高濃度基質(zhì)效應(yīng)分別為102.4%±0.1%、100.6%±0.1%，其RSD均為0.1%（見表1）。

2.5 精密度與準(zhǔn)確度

如表1所示，LST每一濃度水平樣品的批內(nèi)精密度RSD在1.6%～3.5%之間；批間精密度RSD在3.2%～5.3%之間；批內(nèi)準(zhǔn)確度在94.2%～105.2%之間，批間準(zhǔn)確度在93.3%～106.6%之間。LCA每一濃度水平樣品的批內(nèi)精密度RSD在1.3%～4.4%之間；批間精密度RSD在2.5%～4.8%之間；批內(nèi)準(zhǔn)確度在91.9%～101.0%之間，批間準(zhǔn)確度在93.4%～99.5%之間。

圖1 UPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中LST、LCA及內(nèi)標(biāo)d4-LST、d4-LCA的典型色譜圖

圖2 UPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中LST、LCA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 精密度和準(zhǔn)確度、提取回收率結(jié)果

2.6 提取回收率

低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品提取回收率，結(jié)果見表1，LST、LCA的提取回收率平均值分別為109.9%與97.55%。

2.7 穩(wěn)定性

儲(chǔ)備液、工作液的平均穩(wěn)定性及血漿樣本RSD均小于15%，符合相關(guān)要求，如表2、表3所示。

3 應(yīng) 用

本文建立的方法已用于34例健康受試者在3個(gè)周期里餐后單次口服氯沙坦鉀片0.1 g的樣品測(cè)定，均值藥時(shí)曲線見圖3。由圖可知，試驗(yàn)制劑與參比制劑餐后單次給藥LST、LCA的藥時(shí)曲線變化趨勢(shì)一致。代謝物L(fēng)CA的達(dá)峰時(shí)間比藥物L(fēng)ST晚了約3 h，LST在服藥15 h后基本消除。此外，LST與LCA在吸收和分布向的標(biāo)準(zhǔn)偏差均較大，符合氯沙坦鉀作為高變異藥物的特點(diǎn)，與文獻(xiàn)[9-17]報(bào)道一致。

表2 儲(chǔ)備液、工作液的穩(wěn)定性考察結(jié)果（n=3）

表3 血漿樣本的穩(wěn)定性考察結(jié)果（n=3）

圖3 UPLC-MS/MS法測(cè)定人血漿中LST、LCA濃度的均值藥時(shí)曲線圖

4 討 論

在已有文獻(xiàn)報(bào)道的氯沙坦血藥濃度檢測(cè)方法中，Prasaja B等[18]采用了沉淀蛋白法，但其分析時(shí)間較長為3.5 min，血漿用量250 μL，氯沙坦線性范圍2～400 ng/mL，氯沙坦羧酸線性范圍1.85～370 ng/mL；王嫣然等[12]的研究分析時(shí)長2.5 min，但其前處理方法為相對(duì)麻煩的液液萃取法且血漿用量高達(dá)500 μL；方翼等[17]采用沉淀蛋白法，分析時(shí)長3 min，血漿用量50 μL，但其檢測(cè)的是健康受試者口服50 mg氯沙坦鉀片的血漿濃度。本試驗(yàn)在以上研究方法的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)，以乙腈沉淀蛋白后甲酸水溶液稀釋進(jìn)樣，對(duì)稀釋劑甲酸水的濃度進(jìn)行了考察，配制比例為0.5%、0.75%、1%以及2%的甲酸水，結(jié)果顯示甲酸的濃度對(duì)峰寬及靈敏度有一定影響，當(dāng)1%甲酸水作稀釋劑時(shí)峰形最優(yōu)、響應(yīng)最高。試驗(yàn)采用梯度洗脫，待樣本出峰后用98%乙腈沖洗色譜柱后再平衡進(jìn)樣，每個(gè)樣本分析時(shí)間也僅需2.1 min，使基質(zhì)效應(yīng)降到最低，保證了樣本分析的重現(xiàn)性及穩(wěn)定性。

通常非極性和弱極性的化合物易獲得良好的峰形，而帶有－COOH、－NH2、－NHR、－NR2等極性基團(tuán)的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾。由于氯沙坦及其代謝物氯沙坦羧酸的結(jié)構(gòu)中均有含氮五元環(huán)、羥基和羧基等極性結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)在流動(dòng)相中加入了適量的甲酸以改善峰形，對(duì)甲酸的濃度以及是否加入氨進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相中僅含0.05%甲酸時(shí)，色譜峰易分叉，含0.15%甲酸時(shí)峰形改善，但在梯度沖洗有系統(tǒng)峰干擾測(cè)定，且LCA峰仍有拖尾現(xiàn)象，再加入0.04%氨后峰形達(dá)到最優(yōu)，且通過調(diào)整梯度無系統(tǒng)峰干擾。本試驗(yàn)初期（夏天）流動(dòng)相B相使用純乙腈，依次加入0.15%甲酸和0.04%氨時(shí)乙腈未出現(xiàn)白色結(jié)晶，在12月份測(cè)定樣本時(shí)發(fā)現(xiàn)B相有白色結(jié)晶析出，經(jīng)分析甲酸銨在純乙腈中溶解性低，冬天室溫降低時(shí)容易析出，在純乙腈中加入2%純水（甲酸銨的良溶劑）即解決溶解性問題。

5 結(jié)束語

本研究采用同位素標(biāo)記藥物為內(nèi)標(biāo)，建立了UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，沉淀蛋白法同時(shí)測(cè)定人血漿中氯沙坦及其代謝物氯沙坦羧酸的血藥濃度。該方法血漿用量少（僅需50 μL），運(yùn)行時(shí)間短（僅為2.1 min，含沖柱和平衡時(shí)間），線性范圍廣（LST：2.00～2 000 ng/mL，LCA：2.40～2 400 ng/mL），重現(xiàn)性好，適用于高通量的樣本分析工作，已成功應(yīng)用于氯沙坦鉀片（0.1 g）在健康志愿者的生物等效性研究。