陳 英，喬 軍，孟慶玲*，鐘文強(qiáng)，劉田莉，貢莎莎，王熙鳳，黃運(yùn)福，才學(xué)鵬

(1.石河子大學(xué)動物疾病防控兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】細(xì)粒棘球蚴病俗稱包蟲病，是由細(xì)粒棘球絳蟲的幼蟲——細(xì)粒棘球蚴(Echinococcusgranulosus,Eg)寄生于哺乳動物臟器內(nèi)所引發(fā)的嚴(yán)重危害人體健康與畜牧業(yè)發(fā)展，呈全球性分布的一種人畜共患寄生蟲病。我國是受該病影響最為嚴(yán)重的國家之一，其中新疆是發(fā)病率最高的地區(qū)之一[1]。該病不僅嚴(yán)重影響著居民的健康生活，而且致使許多患者家庭因病返貧，對當(dāng)?shù)氐纳鐣?jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重的影響。由于包蟲病具有發(fā)病緩慢、易傳播的特點(diǎn)，給該病的防控帶來了較大的困難[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研發(fā)有效的診斷試劑是該病防控的關(guān)鍵。目前，已被發(fā)現(xiàn)和鑒定的對于包蟲病的免疫診斷所用抗原主要是通過粗提囊液蛋白、原頭節(jié)而獲得的，雖然具有很高的敏感性，但和其它寄生蟲病患者血清存在嚴(yán)重的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致診斷的特異性不夠理想[4-5]。因此，篩選靈敏性強(qiáng)、特異性高的抗原顯得尤為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，EgHSP20抗原基因可在六鉤蚴階段高效表達(dá)[2]，為弄清EgHSP20是否具有反應(yīng)原性，【本研究切入點(diǎn)】本試驗(yàn)對EgHSP20基因進(jìn)行克隆，分析其重要的功能位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域以及抗原表位等分子特征，并在大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定了重組蛋白EgHSP20的反應(yīng)原性，【擬解決的關(guān)鍵問題】為深入研究EgHSP20重組蛋白在包蟲病診斷中的潛在價值奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株與試劑

表達(dá)載體pET-32a、菌株E.coliDH5α和E.coliBL21均由本實(shí)驗(yàn)室保存；組織總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒、T4 DNA 連接酶、PCR 反應(yīng)試劑、pMD19-T載體、限制性內(nèi)切酶EcoR I 和HindⅢ均購自TaKaRa公司。cECL Western Blot Kit與辣根酶標(biāo)記的兔抗綿羊IgG購自北京康為世紀(jì)生物公司。蛋白純化試劑盒購自德國 Novagen 公司。綿羊細(xì)粒棘球蚴病陽性血清由中國農(nóng)科院蘭州獸醫(yī)研究所提供。

1.2 Eg HSP 20的引物設(shè)計

根據(jù)GenBank發(fā)表的EgHSP20基因序列，經(jīng)引物設(shè)計軟件Premier 5.0設(shè)計綿羊細(xì)粒棘球蚴EgHSP20基因抗原(APAU02000015.1)的特異性引物。上游引物為：GGAATTCATGTCGATTTTCCCTGTTC(斜體為保護(hù)性堿基，下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn))，下游引物為：CCCAAGCTTTCATTTAAAGAGAGGTGCC(斜體為保護(hù)性堿基，下劃線為HindⅢ酶切位點(diǎn))；引物由(北京)華大基因科技股份有限公司合成。

1.3 Eg HSP 20基因的RT-PCR擴(kuò)增

將Eg囊液于離心管中，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，將沉淀(含有原頭蚴的樣本)根據(jù)組織總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用20 μl RT-PCR反應(yīng)體系：H2O 9 μl，PCR Mixture 8 μl，cDNA模板2 μl，上下游引物各0.5 μl。EgHSP20基因PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min 15 s，33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min； 將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳，通過DNA 回收試劑盒對PCR產(chǎn)物純化回收。

1.4 目的基因的序列測定及分析

將純化回收后的EgHSP20目的基因片段和pMD19-T載體于4 ℃過夜連接后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR篩選陽性克隆菌，提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切驗(yàn)證后進(jìn)行測序。將測序結(jié)果用MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan) 預(yù)測編碼蛋白的糖基化、磷酸化修飾位點(diǎn)；DNASTAR (Jameson Wolf方法)對其抗原表位進(jìn)行預(yù)測。通過TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測信號肽；對不同物種間的EgHSP20氨基酸序列進(jìn)行同源性比對與分析。通過MEGA5.0軟件(Neighbor-joining Method)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(bootstrap為1000)。

1.5 重組質(zhì)粒pET-Eg HSP20的構(gòu)建與鑒定

將測序正確的pMD-EgHSP20質(zhì)粒與原核表達(dá)載體pET-32a經(jīng)內(nèi)切酶EcoR I 和HindⅢ于37 ℃條件下分別進(jìn)行雙酶切，并分別回收EgHSP20目的基因片段與載體片段，經(jīng)T4 DNA連接酶4 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，于氨芐抗性平板37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單個菌落，通過PCR和雙酶切方法篩選陽性克隆。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及Western blot鑒定分析

將重組質(zhì)粒pET-EgHSP20轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，加入終濃度為1.0 mmol/L的誘導(dǎo)劑IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。在誘導(dǎo)0、4、6、8 h后分別收集菌體和菌液，進(jìn)行SDS-PAGE分析鑒定。用鎳柱親和層析法純化重組蛋白。將純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉(10 %)封閉2 h，加一抗(包蟲病綿羊陽性血清)室溫孵育 1～2 h，TBST buffer 洗滌 3～5 次，加入HRP 標(biāo)記的兔抗綿羊 IgG，室溫孵育 2 h 后用TBST buffer 洗滌 3～5 次，加入顯色劑避光顯色1～2 min。經(jīng)Western blot鑒定，分析重組蛋白的反應(yīng)原性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eg HSP20基因的RT-PCR擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳可檢測到約945 bp的目的條帶，與GenBank中公布的EgHSP20基因片段大小相符(圖1)。將目的條帶純化回收，克隆至pMD19-T載體內(nèi)，轉(zhuǎn)至(E.coliDH5α)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定篩選陽性克隆菌。

2.2 Eg HSP20基因的序列測定及分析

經(jīng)測序，EgHSP20 cDNA開放閱讀框?yàn)?45 bp，編碼314個氨基酸。同源性分析軟件比對發(fā)現(xiàn)，與GenBank中發(fā)表的EgHSP20基因序列同源性達(dá)99.05 %。在第66～71個堿基處由CCCCCC變?yōu)镚AGTTT。在第74個堿基處由C變?yōu)镚。在第269個堿基處由G變?yōu)锳。該蛋白含有1個N端糖基化位點(diǎn)，1個CAMP磷酸化位點(diǎn)，5個PKC磷酸化位點(diǎn)，10個CKⅡ磷酸化位點(diǎn)；抗原表位區(qū)集中在39～53、120～168位(圖2)。該蛋白無跨膜區(qū)域，無信號肽。EgHSP20和其它寄生蟲間氨基酸序列的比較及遺傳進(jìn)化分析顯示，EgHSP20與牛帶絳蟲(TaeniasaginataHSP20，TaensagHSP20)位于同一遺傳分支，二者的親緣關(guān)系最近，同源性為86 %；而與肝片吸蟲、口膜殼絳蟲、華支睪吸蟲、日本血吸蟲、口膜殼絳蟲、曼氏裂體吸蟲及衛(wèi)氏并殖吸蟲的HSPs均低于40 %(圖3～4)。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～2：RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 Eg HSP20基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of Eg HSP 20 gene by RT-PCR

2.3 Eg HSP 20基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

經(jīng)菌液PCR篩選鑒定陽性重組菌(圖5)。通過EcoR I /HindⅢ雙酶切驗(yàn)證得到 945 bp的目的條帶和 5900 bp 的pET-32載體片段(圖6)，表明已成功構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET-EgHSP20。

2.4 重組蛋白Eg HSP 20在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

IPTG分別誘導(dǎo)0、4、6、8 h后， SDS-PAGE檢測分析結(jié)果顯示，重組蛋白EgHSP20相對分子質(zhì)量約為51 kDa，6 h時表達(dá)量最高?？扇苄苑治鲲@示，重組蛋白EgHSP20主要以包涵體形式存在。Western blot分析結(jié)果顯示，在相對分子質(zhì)量約51 kDa處出現(xiàn)特異性的單一反應(yīng)條帶，顯示重組蛋白能和綿羊Eg陽性血清發(fā)生特異性的反應(yīng)，表明重組蛋白EgHSP20具備良好的反應(yīng)原性(圖7)。

引物序列(下劃線)；N端糖基化位點(diǎn)(虛線框)；CAMP磷酸化位點(diǎn)(雙下劃線)；PKC磷酸化位點(diǎn)(灰色陰影部分)；CKⅡ磷酸化位點(diǎn)(波浪線)；抗原表位集中區(qū)(方框)圖2 Eg HSP20 cDNA核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide sequence and deduced amino acids sequence of Eg HSP20 cDNA

Eg HSP20:細(xì)粒棘球蚴；Fashe HSPs:肝片吸蟲；Hymic HSP20:口膜殼絳蟲；Clonorchis sinensis:華支睪吸蟲；Schi jap HSP 20:日本血吸蟲；Hym mic HSP20:口膜殼絳蟲；Schi man HSP20:曼氏裂體吸蟲；Parwes egg antigen:衛(wèi)氏并殖吸蟲；Taenia saginata HSP20:牛帶絳蟲圖3 不同寄生蟲HSP20蛋白氨基酸序列比較Fig.3 Comparison of amino acid of HSP20 protein among different parasites

Eg HSP20:細(xì)粒棘球蚴；Fashe HSPs:肝片吸蟲；Hymic HSP20:口膜殼絳蟲；Clonorchis sinensis: 華支睪吸蟲；Schi jap HSP 20:日本血吸蟲；Hym mic HSP20:口膜殼絳蟲；Schi man HSP20:曼氏裂體吸蟲；Parwes egg antigen:衛(wèi)氏并殖吸蟲；Taen sag HSP20:牛帶絳蟲圖4 幾種代表性寄生蟲HSP20蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic analysis of several representative worm based on HSP20 gene

3 討 論

目前已被發(fā)現(xiàn)與鑒定的Eg抗原主要包括囊液粗提抗原、原頭節(jié)、抗原5、Eg95、Eg10和EgAgB等[2-4]。Zhang等通過臨床實(shí)驗(yàn)已證實(shí)囊液粗提抗原的敏感性為75 %～95 %，但其特異性比較差，存在一定缺陷，能和多房棘球絳蟲、豬帶絳蟲等其它絳蟲病、線蟲及吸蟲等存在交叉反應(yīng)，影響實(shí)際診斷的準(zhǔn)確性。而抗原5、Eg10和EgAgB等重組抗原特異性較高，但敏感性較低，給確診帶來困難[2]。因此，篩選具有強(qiáng)反應(yīng)原性的細(xì)粒棘球蚴特異性抗原顯得尤為重要[6]。

M: DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1～4: 菌液PCR產(chǎn)物圖5 pET-Eg HSP20載體PCR鑒定Fig.5 Identification of pET-Eg HSP 20 by PCR

HSPs是生物體在不利于自身因素刺激下所產(chǎn)生一種可溶性的應(yīng)激蛋白。正常狀態(tài)下在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，應(yīng)激時呈現(xiàn)高表達(dá)，有著應(yīng)激保護(hù)作用[7-8]。且能作用于抗原提呈細(xì)胞而刺激細(xì)胞因子的分泌，參與免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化與激活[9-12]。有研究發(fā)現(xiàn)，許多寄生蟲的熱休克蛋白(HSPs)不僅參與蛋白的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞的凋亡[13-15]、機(jī)體免疫等多種生理功能[16-18]，而且還具有較強(qiáng)的免疫原性，在基因疫苗中還可提高免疫效能的專一性，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)[19-21]。Snoeckx 等(2001)根據(jù)氨基酸序列結(jié)構(gòu)、生物功能與相對分子質(zhì)量的大小，將 HSPs分為小分子 HSP、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等家族[10,14]。其中HSP70已被證實(shí)對血吸蟲、瘧原蟲、錐蟲等寄生蟲尤其是對棘球絳蟲具有重要診斷應(yīng)用價值[12-13,17-18]。郭愛疆等(2004)從豬囊尾蚴蟲體中擴(kuò)增出小熱休克蛋白，經(jīng)研究證實(shí)該蛋白能夠和豬囊蟲患畜血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性[16,22-23]。HSP20屬于小分子熱休克蛋白家族的一員，在六鉤蚴和原頭蚴階段表達(dá)量明顯超過了HSP70，在細(xì)粒棘球絳蟲蟲卵中發(fā)揮著重要作用[2]。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：pET-32a菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8h表達(dá)產(chǎn)物；2～5：pET-Eg HSP20菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)0 、4 、6 和8 h表達(dá)產(chǎn)物；6～7：pET-Eg HSP 20菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)8 h超聲破碎后上清和沉淀；8：純化的重組蛋白；9：Western blot分析圖7 目的蛋白Eg HSP 20 SDS-PAGE和Western blot分析Fig.7 Analysis of recombinant protein Eg HSP 20 by SDS-PAGE and Western blot

4 結(jié) 論

為尋找特異性高、敏感性強(qiáng)的包蟲病診斷抗原奠定基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)篩選出了在細(xì)粒棘球蚴幼蟲階段熱休克蛋白家族中表達(dá)量較高，且至今尚未被深入研究的Eg-HSP20基因進(jìn)行克隆，測序后對它重要的功能位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域、信號肽及抗原表位進(jìn)行生物信息分析，成功構(gòu)建了pET-Eg-HSP20原核表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)了在E.coliBL21中高效表達(dá)。SDS-PAGE可檢測到約51 kDa蛋白大小的特異性條帶；Western blot鑒定顯示，Eg-HSP20重組蛋白能夠特異性的識別Eg陽性血清，證實(shí)此蛋白具有良好的反應(yīng)原性，具有作為包蟲病診斷候選抗原分子的潛在價值。