康 浩，蘇初連，梅志棟，楊石有，劉曉妹，蒲金基，張 賀*

(1.海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；3.澄邁縣農(nóng)業(yè)局，海南 澄邁 571900)

Lasiodiplodiatheobromae是發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū)常見(jiàn)的一種病原真菌[1]。芒果蒂腐病是芒果采后的主要病害，也是世界芒果主產(chǎn)區(qū)的主要病害之一。可可球二孢蒂腐菌(Lasiodiplodiatheobromae)在幼果期侵入并潛伏于果實(shí)中，潛伏期長(zhǎng)，擴(kuò)展迅速，常溫下3～5 d即可導(dǎo)致整個(gè)果實(shí)腐爛[2]，儲(chǔ)藏期病果率一般為10 %～40 %，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可達(dá)100 %[3]，在我國(guó)芒果主產(chǎn)區(qū)內(nèi)普遍發(fā)生。【研究意義】寄主植物被病原菌侵染時(shí)能夠激活自身抗病防御酶基因高效表達(dá)，從而抵抗病原菌的侵染，提高其抗病性，有助于病害的有效管理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】采后熱處理對(duì)芒果蒂腐病的控制效果不太穩(wěn)定[4]，異菌脲、咪鮮胺等化學(xué)藥劑處理對(duì)該病有一定控制效果，但易產(chǎn)生農(nóng)藥殘留、藥害和抗藥性等問(wèn)題，該病成為影響芒果經(jīng)濟(jì)效益的重要因素之一[2]。有關(guān)于抗性產(chǎn)生的生理生化機(jī)理的研究也很多，如苯丙氨酸解氨酶PAL參與木質(zhì)素和植保素的合成，降低真菌、細(xì)菌侵入時(shí)分泌的果膠酶、β-1,3葡聚糖酶的活性，增加植物細(xì)胞壁厚度，增加植物自身的抗病性[5]；Sticher[6]認(rèn)為過(guò)氧化物酶POD和多酚氧化酶PPO活性的提高可以作為抗性產(chǎn)生的生理生化標(biāo)志[7]。超氧化物歧化酶SOD主要通過(guò)清除植物體內(nèi)由于各種脅迫或傷害引起的過(guò)多自由基，減輕活性氧對(duì)寄主細(xì)胞膜脂的損傷及對(duì)細(xì)胞的破壞作用。因此，這些酶活性增強(qiáng)對(duì)植物的抗病反應(yīng)有著十分重要的作用[8]。本實(shí)驗(yàn)室中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹(shù)病害研究組前期研究發(fā)現(xiàn)誘抗劑BTH處理芒果葉片后可以明顯提高各類(lèi)酶的活性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本文選用芒果蒂腐菌的分生孢子分別接種芒果葉片和果實(shí)，定時(shí)取樣，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR，qRT-PCR)技術(shù)分析了7個(gè)防御酶相關(guān)基因的表達(dá)，再結(jié)合熱度圖綜合評(píng)價(jià)了病原菌侵染所誘導(dǎo)的防御酶基因的表達(dá)情況?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)抗病相關(guān)防御酶基因的差異性表達(dá)以期增強(qiáng)寄主植物對(duì)病原菌的抵抗能力，減緩病原菌在寄主植物內(nèi)的擴(kuò)展，并為了解病原菌與寄主之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：貴妃芒的嫩葉和成熟果采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家芒果種質(zhì)資源圃?xún)?nèi)。

試劑：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒和RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自天根生化科技有限公司；DNA Marker DL 5000為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品，熒光定量試劑盒UltraSYBR Mixture (Low Roe)購(gòu)自康為試劑公司；其它常用試劑均為常規(guī)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 芒果組織總RNA的提取和cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄 供試材料為膠孢炭疽菌分生孢子(濃度為1.0 ×106個(gè)/mL)侵染貴妃芒嫩葉和果皮的組織，于不同時(shí)間點(diǎn)(0，12，24，36，48，72 hpi)取樣，提取不同時(shí)間點(diǎn)組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10倍，備用。

貴妃芒果實(shí)和葉片總RNA的提取參照天根生化科技公司的RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒中的方法。提取各組織的總RNA后，用超微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 2000C型)并結(jié)合2 %的瓊脂糖凝膠電泳，測(cè)定提取RNA的OD，估算RNA濃度，-80 ℃保存作為后續(xù)研究。第一鏈cDNA的合成是按照天根公司的FastQuant RT Kit(with gDNase)試劑盒的方法，供試各個(gè)樣品反轉(zhuǎn)錄的總RNA的量統(tǒng)一為0.5 μg。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以芒果超氧化物歧化酶 (MiSOD) 、多酚氧化酶(MiPPO) 、過(guò)氧化物酶(MiPOD)、幾丁質(zhì)酶(MiCHI)、病程相關(guān)蛋白1(MiPR1)、苯丙氨酸解氨酶 (MiPAL)、生長(zhǎng)素反應(yīng)因子(MiARF)等抗病防御酶基因?yàn)閷?duì)象，內(nèi)參基因?yàn)槊⒐?8 S(Mi18S)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)分析抗病防御酶基因在Lasiodiplodiatheobromae分生孢子侵染貴妃芒嫩葉、果實(shí)時(shí)的表達(dá)量。所用基因引物序列均由北京華大基因合成，PAGE純化。

表1 供試引物序列

采用Quant Studio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，每個(gè)PCR反應(yīng)體系為20 μl：2× Mix 10 μl，cDNA 1 μl，上下游引物各0.5 μl，ddH2O 8 μl，每個(gè)樣本重復(fù)4次。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；50 ℃保存，在72 ℃時(shí)收集熒光信號(hào)。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件(QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System Software)獲得各個(gè)樣品的Ct值，以0 h的表達(dá)量為對(duì)照，運(yùn)用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并對(duì)數(shù)據(jù)采用鄧肯新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析[9]。

參照Deng[10]等人的方法，運(yùn)用HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖，綜合分析各防御酶相關(guān)基因在不同時(shí)間點(diǎn)、不同組織內(nèi)的表達(dá)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lasiodiplodia theobromae侵染芒果果實(shí)時(shí)防御酶相關(guān)基因表達(dá)量分析

通過(guò)qRT-PCR分析抗病防御酶基因在Lasiodiplodiatheobromae分生孢子侵染貴妃芒果實(shí)時(shí)的表達(dá)量，果實(shí)中7個(gè)芒果防御酶基因中活性氧相關(guān)基因(MiPOD、MiPPO)的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間段均差異顯著，活性氧相關(guān)的3個(gè)防御酶基因(MiPOD、MiPPO、MiSOD)表達(dá)量在36 h達(dá)到最大值，但MiPOD、MiPPO在6、12、24、48、72 h的表達(dá)量均低于0 h，MiPPO、MiSOD在6、12、24 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量的變化趨勢(shì)沒(méi)有MiPOD的變化趨勢(shì)快(圖1)；抗病相關(guān)的4個(gè)基因(MiCHI，MiARF，MiPR1和MiPAL)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與活性氧相關(guān)的基因較為相似，也在36 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最大值(圖2)，但MiPR1整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，36 h后的表達(dá)量顯著低于0 h的表達(dá)量，MiCHI，MiPAL在6和12 h時(shí)的表達(dá)量與0 h無(wú)顯著差異。

圖1 芒果果實(shí)3個(gè)活性氧相關(guān)基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)Fig.1 Expression of 3 active oxygen related genes in mango fruits at different time points

圖2 芒果果實(shí)4個(gè)抗性相關(guān)基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of 4 resistance-related genes in mango fruits at different time points

通過(guò)HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖3顯示，Lasiodiplodiatheobromae分生孢子在侵染芒果果皮時(shí)能夠明顯激活7個(gè)防御酶相關(guān)基因的表達(dá)，部分基因在一些時(shí)間點(diǎn)高表達(dá)；接種36 h 時(shí)，7個(gè)基因均高效表達(dá)，明顯高于后續(xù)的時(shí)間點(diǎn)。MiPR1基因在整個(gè)侵染過(guò)程中均持續(xù)性地高表達(dá)，36 h時(shí)仍為最高表達(dá)量，而MiPOD基因除在36 h時(shí)表達(dá)量較0 h時(shí)高，其他時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均較0 h時(shí)偏低。

2.2 Lasiodiplodia theobromae侵染芒果葉片時(shí)防御酶相關(guān)基因表達(dá)量分析

葉片中，7個(gè)芒果防御酶基因中活性氧相關(guān)基因(MiPOD、MiPPO)的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異顯著，活性氧相關(guān)的3個(gè)基因(MiPOD、MiPPO、MiSOD)表達(dá)量在24 h達(dá)到最大值，其中MiPOD、MiPPO在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量均較0 h的高，MiSOD除12、24 h表達(dá)量較0 h顯著增高，其他時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量不顯著；抗病相關(guān)的4個(gè)基因(MiCHI，MiARF，MiPR1和MiPAL)表達(dá)量差異顯著，且變化趨勢(shì)較活性氧相關(guān)基因大。4個(gè)基因中除MiARF外其他3個(gè)均為正調(diào)控表達(dá)，MiARF表達(dá)量呈逐漸下降趨勢(shì)，MiPR1基因的表達(dá)量72 h時(shí)最大，MiCHI基因的表達(dá)量48 h最大(圖4～5)。

圖3 芒果果實(shí)7個(gè)防御相關(guān)基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)圖譜分析Fig.3 Expression patterns of 7 defense-related genes in mango fruits at different time points

圖4 芒果葉片3種活性氧相關(guān)基因在不同時(shí)間表達(dá)分析Fig.4 Expression of 3 active oxygen related genes in mango leaves at different time points

圖5 芒果葉片4種抗性相關(guān)基因在不同時(shí)間表達(dá)分析Fig.5 Expression analysis of 4 resistance-related genes in mango leaves at different time points

通過(guò)HemI 1.0.3.3軟件繪制熱度圖6顯示，Lasiodiplodiatheobromae分生孢子在侵染芒果果皮時(shí)能夠明顯激活7個(gè)防御酶相關(guān)基因的表達(dá)，部分基因在一些時(shí)間點(diǎn)高表達(dá)；除基因MiSOD在6 h、MiARF在48、72 h時(shí)出現(xiàn)負(fù)調(diào)控表達(dá)其他基因在整個(gè)時(shí)間段均為正調(diào)控表達(dá)?；騇iPOD和MiPPO的表達(dá)量呈先上升后下降趨勢(shì)，基因MiCHI持續(xù)高表達(dá)，MiPR1在接種72 h時(shí)出現(xiàn)最高表達(dá)量。

3 討 論

尋找抗病相關(guān)基因?qū)τ诹私獠≡c寄主之間的相互作用機(jī)制有重要意義，有助于病害的有效管理。為抵御各種病原微生物的侵入，寄主植物自身有發(fā)達(dá)的防御機(jī)制，包括利用物理屏障，限制病原體的傳播和產(chǎn)生抗菌化合物抑制病原菌的定殖、生長(zhǎng)。此外，細(xì)胞壁中某些蛋白能識(shí)別病原體引起下游防御反應(yīng)[11]。

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所熱帶果樹(shù)病害研究組前期王芳[12]等人研究發(fā)現(xiàn)200 μg/mL BTH處理芒果葉片后MiPAL、MiPPO、MiCAT、MiSOD、MiPOD等5種抗病相關(guān)基因的酶活性均顯著提高。王媛[8]等研究發(fā)現(xiàn)病原菌侵染寄主組織后，寄主組織被侵染部位酶的活性增加，感病后酶活性增加越快，植物的抗病性就強(qiáng)，反之則減弱。

圖6 芒果葉片7個(gè)防御相關(guān)基因在不同時(shí)間的的表達(dá)圖譜分析Fig.6 Expression patterns of 7 defense-related genes in mango leaves at different time points

植物的抗病性與POD酶有關(guān)，POD酶的高活性是植物抗病的生化機(jī)制之一[8]。病原菌侵染后會(huì)引起寄主組織中CAT活性下降[13]，而POD和APX的活性會(huì)增加[14]。超氧化物歧化酶SOD能夠清除植物體內(nèi)過(guò)多自由基，減輕活性氧對(duì)寄主細(xì)胞及細(xì)胞脂膜的損傷和破壞作用；H2O2能夠在細(xì)胞間穩(wěn)定傳輸，高濃度的H2O2可以引起植物病變部位的過(guò)敏性反應(yīng)直接殺死入侵病原菌，啟動(dòng)膜脂過(guò)氧化，引起細(xì)胞死亡，在抗病中起作用[15]。

4 結(jié) 論

Lasiodiplodiatheobromae分生孢子侵染芒果嫩葉和成熟果實(shí)，能夠不同程度地誘導(dǎo)MiPOD、MiPPO、MiCHI、MiPR1等7個(gè)防御酶基因的表達(dá)，激發(fā)寄主植物對(duì)病原菌的抵抗能力，起到延緩病原菌在寄主組織內(nèi)的迅速擴(kuò)展的作用。