吳志明，鹿承建，章帥文，祁增興，朱曼寧，李昆太

(江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實驗室/江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，江西 南昌 330045)

【研究意義】目前，抗生素濫用導致各種病害產(chǎn)生耐藥或抗藥性，嚴重危害農(nóng)業(yè)和食品的生產(chǎn)安全，甚至威脅人類生命健康[1]。因此，在綠色、安全生態(tài)日趨受全球關注的時代，愈發(fā)需要新型高效、廣譜安全和低毒環(huán)保的拮抗微生物來抑制或殺死有害微生物，為農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)療領域的可持續(xù)發(fā)展提供有力保障[2-3]。【前人研究進展】放線菌是許多胞外酶和抗生素的知名生產(chǎn)者，尤其是鏈霉菌屬[4-5]憑借易分離培養(yǎng)、產(chǎn)多種次級代謝物等特點，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)病害防治、食品防腐和醫(yī)學領域，如：紅霉素[6]，梧寧霉素[7]等。據(jù)統(tǒng)計，目前約有60 %的農(nóng)用抗生素是由鏈霉菌產(chǎn)生的[8]。其中，吸水鏈霉菌檸檬色變種(S.hygroscopicusvar.limoneus)產(chǎn)生的井岡霉素(Validamycin A)、可可鏈霉菌阿索變種(S.cacaoivar.asoensis)產(chǎn)生的多氧霉素(Polyoxins)和灰色產(chǎn)色鏈霉菌(S.griseochromogenes)產(chǎn)生的滅瘟素(Blasticidin S)已成功運用于農(nóng)作物的真菌病害防治中[9]；據(jù)報道，納他霉素(Natamycin)是一種廣譜高效、被廣泛應用于臨床和食品工業(yè)等領域的二十六元多烯大環(huán)內酯類真菌抑制劑，是恰塔努加鏈霉菌(Streptomyceschatanoogensis)、納塔爾鏈霉菌(Streptomycesnatalensis)和褐黃孢鏈霉菌(Streptomycesgilvosporeus)等經(jīng)深層發(fā)酵產(chǎn)生的次級代謝物[10]?！颈狙芯壳腥朦c】本研究先期以水稻紋枯病菌為靶目標，分離篩選到一株產(chǎn)新型抗真菌活性物質(1-甲基-3-氧代-6-氮雜二環(huán)[3.1.1]-5(7)-庚烯-2-酮，分子式為C6H7O2N，暫命名為農(nóng)抗N2)的鏈霉菌新種Streptomycessp. N2[11]?！緮M解決的關鍵問題】擬通過開展Streptomycessp. N2代謝粗提物拮抗不同植物病原真菌、酵母、G+和G-的活性評價和探索新型Streptomycessp. N2代謝粗提物對離體水果的生防實效及其保鮮作用，為Streptomycessp. N2未來在農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等領域的開發(fā)與應用提供有力的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株來源 鏈霉菌 N2(Streptomycessp.N2)分離自云南省昆明市西山國際森林公園；指示菌(本實驗室保存)：革蘭氏陽性G+：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，克氏庫克菌(MicrococcusKristinae)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)；革蘭氏陰性G-：惡臭假單胞桿菌(Pseudomonasputida)，水稻黃單胞菌(Xanthomonasoryzae)，大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)；真菌：酵母菌(Yeast)，辣椒疫病菌(Phytophthoracapsici)，葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)，西瓜枯萎病菌(Fusarriumoxysporumf.sp.niveum)，意大利青霉(Penicilliumitalicum)，黑曲霉(Aspergillusniger)，棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.vasinfectum)，煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)，指狀青霉(Penicilliumdigitatum)，水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)，桔青霉(PenicilliumcitrinumThom)，萵苣菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)，棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)，水稻稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：用于細菌的斜面保存和抑菌活性的檢測；PDA培養(yǎng)基：用于真菌的斜面保存和抑菌活性的檢測；鏈霉菌N2發(fā)酵培養(yǎng)液：蔗糖40 g，玉米淀粉20 g，玉米漿20 g，黃豆餅粉10 g，(NH4)2SO42 g，KH2PO41 g，MgSO41 g，MnSO40.01 g，ZnSO40.01 g，H2O 1 L，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 儀器與設備 JW-3022HR型高速冷凍離心機，安徽嘉文儀器裝備有限公司；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-250A生化培養(yǎng)箱，韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 N2粗提物的制備 將培養(yǎng)7 d的鏈霉菌N2孢子刮入30 mL帶玻璃珠的無菌蒸餾水中，震蕩20 min后移取5 mL孢子懸液于裝有50 mL種子培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，160 r·min-1、30 ℃振蕩培養(yǎng)48 h即得鏈霉菌N2種子液。種子液按10 %的接種量轉接至含500 mL發(fā)酵培養(yǎng)液的2 L三角瓶中，160 r·min-1、30 ℃培養(yǎng)96 h即為鏈霉菌N2發(fā)酵液；鏈霉菌N2發(fā)酵液經(jīng)兩倍體積乙醇(純度≥90 %)浸提至少24 h后4000 r·min-1離心棄除菌體，上清液以旋轉蒸發(fā)器濃縮后于10 000 r·min-1離心保留上清液，最后用0.22 μm濾膜過濾除菌即得無菌粗提物原液。用無菌蒸餾水稀釋無菌粗提物原液制成不同濃度藥液，備用。

1.2.2 N2粗提物抑菌譜的測定 參考文獻[12]測定N2粗提物對12種待測植物病原真菌的抑制作用，處理組：200 mLPDA與15 mLN2粗提物原液混勻制成含藥平板(Φ90 mm)，用Φ9mm無菌打孔器制取菌塊置于平板中央，以含等量無菌水為對照，每個處理重復5次，28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d后測量菌落直徑，計算抑制率。

參考文獻[13]測定N2粗提物對供試酵母菌、革蘭氏陽性G+和G-菌的抑菌活性，用50 mL無菌水將待測指示菌制成菌懸液后，移取200 μl均勻涂布于相應固體培養(yǎng)基上，15 min后小心放入無菌牛津杯，加入200 μl不同濃度N2粗提物。以無菌水為CK對照，各處理重復3次，24 h后測量抑菌圈直徑并記錄。

1.2.3 建立N2粗提物對不同植物病原真菌的毒力回歸方程及其MIC的測定 參考文獻[14]測試植物病原真菌對N2粗提物的敏感性以及N2粗提物相應的最低抑菌濃度MIC：將不同濃度無菌N2粗提物與冷卻至60 ℃的PDA培養(yǎng)基混勻制成系列濃度的含藥平板后，采用1.3.2中的方法接種和培養(yǎng)不同植物病原真菌，每處理3～5次重復，觀察菌絲生長情況并采用十字交叉法測量菌落直徑，利用DPS統(tǒng)計軟件，采用劑量對數(shù)-抑菌率機率值法建立毒力回歸方程，計算EC50；以72 h后抑制病原菌生長的最低藥物濃度為MIC。

1.2.4 N2粗提物對離體果實的生物防效測定 經(jīng)75 %酒精和1 %次氯酸鈉表面消毒后的健康獼猴桃(隨機挑選、大小一致)，采用有傷接種的方式將活化后的葡萄座腔菌接種于果實赤道部位一側, 噴施5 mL不同濃度的N2粗提物，并用濕潤的無菌棉花蓋住傷口，以均不噴藥但分別接種病原菌和無菌PDA塊為CK和陰性對照組。置于(25±2)℃恒溫保濕(相對濕度75 %)培養(yǎng)箱中7 d。觀察并記錄獼猴桃染病面積，參考公式:相對防效(%)=(CK處理組感病面積-藥液處理組感病面積)×100 %/CK處理組感病面積。

1.2.5 N2粗提物對不同水果的保鮮作用 將大小、成熟度一致的廣西金黃圣女果、云南夏黑葡萄和雞蛋芒果用清水洗凈晾干后隨機分成3組，處理組: 2.31 μg·mL-1N2粗提物，陽性對照組: 10 μg·mL-1納他霉素，CK：清水對照。用無菌脫脂棉在待測水果表面均勻涂抹不同處理液后置于保鮮袋中，(30±2)℃恒溫保濕貯藏10 d，各處理3次重復，每天稱重并計算失重率，同時觀察水果顏色、氣味和硬度等貯藏品質的變化。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析 采用Excel 2010、DPS 7.05、Origin 9.0和Adobe Photoshop CS5進行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結果與分析

2.1 N2粗提物對不同植物病原真菌抑菌率的影響

由表1可見，經(jīng)農(nóng)抗N2粗提物處理后12種植物病原真菌的菌落直徑較CK組均明顯減小，尤以農(nóng)抗N2粗提物對辣椒疫病菌、葡萄座腔菌、意大利青霉、煙草黑脛病菌和桔青霉的抑制效果較為顯著，抑菌率分別達83.58 %、94.55 %、96.24 %、88.96 %和85.49 %；由此進一步驗證了農(nóng)抗N2粗提物中存在廣譜拮抗植物病原真菌的活性物質。

2.2 N2粗提物對酵母菌、革蘭氏陽性G+ 和G-菌的拮抗作用

通過管碟法測試結果可知(圖1)：不同濃度N2粗提物對酵母菌和多種革蘭氏陽性、陰性細菌均有顯著的抑制效果，且隨著濃度的升高抑菌圈直徑越大；其中對G+抑制效果最佳為枯草芽孢桿菌，對G-抑制效果最佳為水稻黃單胞菌，當處理濃度為2.88 μg·mL-1時抑菌圈大小分別為：(24.82±2.61)和(25.57±1.43)mm；結合2.1.1結果可知鏈霉菌N2擁有廣譜拮抗的特性，可能存在多種抗菌活性物質。

表1 N2粗提物對不同植物病原真菌抑菌率的影響

注：a中±SD(standard deviation)表示處理間重復的標準差。

Note:aThe results were means±SD (standard deviation) of triplicate determinations.

圖1 N2粗提物對酵母菌、G+ 和G-菌的抑菌圈直徑Fig.1 Inhibition zone diameters of S. cerevisiae, G+ and G- by N2 crude extract

2.3 8種植物病原真菌對N2粗提物的敏感性和N2粗提物的最低抑菌濃度

EC50是有效反映生防菌拮抗病原菌作用強弱的重要指標，由表2可知，N2粗提物能有效抑制8種供試菌的生長。試驗中N2粗提物對8種供試菌的EC50值由小到大依次為：辣椒疫病菌、稻瘟病菌、葡萄座腔菌、萵苣菌核病菌、紋枯病菌、煙草黑脛病菌、棉花枯萎病菌和西瓜枯萎病菌，N2對以上供試菌的MIC值分別為：2.88、2.88、5.77、5.77、5.77、11.53、11.53和13.45 μg·mL-1，與EC50值相符，逐漸變大。

2.4 N2粗提物對離體獼猴桃的生物防效

經(jīng)離體果實生防試驗發(fā)現(xiàn)：如圖2所示，不同濃度N2粗提物處理后彌猴桃果實感病面積顯著小于CK組，相比CK組被葡萄座腔菌侵染了(5.05±0.28)cm2的感病面積，經(jīng)23.06、115.30 μg·mL-1藥液處理后相對防效分別達7.53 %和46.64 %，差異顯著；230. 60 μg·mL-1能完全抑制葡萄座腔菌在獼猴桃果實上的感染，同時陰性對照組的離體果實未見感病面積，表明培養(yǎng)環(huán)境良好，排除了其他病原菌對本試驗的干擾；因此可見，N2粗提物具有顯著的生物防效作用。

圖中無相同小寫字母的表示各處理間差異顯著(P<0.05)Different lowercase letters above the columns represent statistically significant (P<0.05) differences among treatments圖2 N2粗提物對離體獼猴桃的生物防效Fig.2 The in vitro biocontrol efficacy of N2 crude extract in Actinidia chinensis Planch

2.5 N2粗提物對3種水果失重率的影響

由圖3可知，貯藏時間延長，各處理的水果失重率均呈上升趨勢，貯藏10 d后圣女果CK失重率為12.62 %，納他霉素和N2處理組分別為10.04 %和7.34 %，均明顯低于CK，與CK差異極顯著(P<0.01)；葡萄CK、陽性對照和N2處理組失重率分別為15.89 %、13.68 %和11.62 %，且納他霉素和N2處理組相比CK差異顯著(P<0.05)；而芒果各處理間失重率無顯著差異。由此可見，N2粗提物和納他霉素能有效抑制圣女果和葡萄水分的散失，且2.31 μg·mL-1N2粗提物效果較10 μg·mL-1納他霉素更佳。

2.6 N2粗提物對3種水果貯藏品質的影響

由圖4可見，圣女果和葡萄經(jīng)N2粗提物和納他霉素處理10 d后，在貯藏前后相比CK組的果實顏色及其硬度均無顯著變化，尤以N2粗提物處理組效果最為明顯，且在實驗過程中發(fā)現(xiàn)隨著貯藏時間的延長，CK組中圣女果果蒂脫落、腐爛并伴有惡心臭味，葡萄表面開裂且出現(xiàn)腐斑。芒果經(jīng)N2粗提物和納他霉素處理5 d后，相比CK組雖失重率無顯著差異，但其貯藏品質明顯下降，并隨貯藏時間延長芒果表面出現(xiàn)嚴重腐爛黑斑，散發(fā)腐爛味。因此可以推斷，N2粗提物中的抑菌活性物質能有效水果樣品表面有害菌的生長，提高水果貯藏品質。

表2 8種植物病原真菌對N2粗提物的敏感性和N2粗提物的最低抑菌濃度

圖3 N2粗提物對離體水果失重率的影響Fig.3 Effect of N2 crude extract on isolated fruit weight loss rate

圖4 N2粗提物對離體水果貯藏品質的影響Fig.4 Effect of N2 crude extract on isolated fruit storage quality

3 討 論

植物病害是影響作物優(yōu)質高產(chǎn)和果蔬采后貯藏最重要的制約因素之一，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計，每年因植物病害造成的減產(chǎn)損失高達總產(chǎn)量的10 %～15 %[15]。其中，70 %～80 %的植物病害是病原真菌侵染所致[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌N2粗提物對辣椒疫病菌、葡萄座腔菌、西瓜枯萎病菌、意大利青霉、黑曲霉、棉花枯萎病菌、煙草黑脛病菌、指狀青霉、水稻紋枯病菌、桔青霉、萵苣菌核病菌、棉花黃萎病菌、水稻稻瘟病菌等多種植物病原真菌均具有較強抑菌活性。此外，鏈霉菌次級代謝系統(tǒng)復雜，能產(chǎn)生諸多結構新穎、生物活性顯著的次級代謝物是鏈霉菌具備高效、廣譜拮抗性的重要原因之一。由研究結果可推測：鏈霉菌N2代謝粗提物中存在能有效抑制腐敗酵母、常見的食品腐敗細菌(枯草芽孢桿菌G+、惡臭假單胞桿菌G-)、植物細菌性病害(水稻黃單胞菌G-)和動物致病菌(大腸埃希氏菌G-和克氏庫克菌G+)的活性物質。涂國全[17-18]等在以棉花枯萎病為靶標的農(nóng)用抗生素產(chǎn)生菌的分離篩選中，從棉花地土壤中分離篩選到一株能抑制酵母、G+、G-和霉菌，產(chǎn)多種抗菌物質的鏈霉菌702。與本研究相似，因此推測Streptomycessp.N2也是一種能分泌多種生物活性物質的生防菌，其次級代謝產(chǎn)物有待進一步開發(fā)。

獼猴桃果實腐爛病主要是由葡萄座腔菌、鏈格孢菌Alternariaalternata、擬莖點霉菌Phomopsismacrospore、富氏葡萄孢盤菌Botryotiniafuckeliana、和層出鐮刀菌Fusariumproliferatum引起的真菌性病害，其中B.dothidea不僅能從獼猴桃果實傷口侵入引發(fā)病害，更具有從果實表面直接侵入造成腐爛發(fā)病的能力[19]。本研究通過離體獼猴桃果實的生物防效試驗發(fā)現(xiàn)，N2粗提物能顯著抑制B.dothidea經(jīng)傷口侵染獼猴桃果實，防止果實發(fā)病。果蔬中的水分是維持生命活動和保持新鮮品質的重要條件，采后貯藏過程中水分的散失是造成果實外觀色澤、質地和風味變化的主要原因[20]。試驗結果表明，N2粗提物能涂抹處理后能有效降低水果的失重率，保持果實的風味和色澤等貯藏品質，且其效果較納他霉素更佳。推測可能是N2粗提物在水果表面形成一個半透性薄膜，減緩水果的蒸騰和呼吸作用，抑制有害微生物的入侵和滋生，從而延緩水果保質期。

4 結 論

由此可見，Streptomycessp.N2能有效抑制不同病原菌的生長，其擁有廣闊的開發(fā)應用前景。但目前針對除農(nóng)抗N2外的其他Streptomycessp.N2所產(chǎn)活性物質的種類結構、特性及其抑菌機理研究還不清楚，是否本研究中的抑菌和保鮮作用均由農(nóng)抗N2發(fā)揮抑菌作用也有待進一步探索。