甘玉迪，孫康，李會(huì)娟，堵忠穎，趙真，龐鑫，黎星輝，陳暄

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兩種原核表達(dá)載體對(duì)CsPPO蛋白表達(dá)活性的影響

甘玉迪，孫康，李會(huì)娟，堵忠穎，趙真，龐鑫，黎星輝，陳暄*

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095

為了選擇合適載體，獲得穩(wěn)定表達(dá)且具有高活性的可溶性茶樹(shù)多酚氧化酶，本研究以茶樹(shù)葉片為材料，克隆茶樹(shù)多酚氧化酶基因（CsPPO），切除含43個(gè)氨基酸和70個(gè)氨基酸的肽段后分別與pET32a載體、pMAL-c5X載體進(jìn)行重組構(gòu)建原核表達(dá)載體，分別命名為pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-PPO43、pMALc5X-CsPPO70，利用Transetta（DE3）菌株進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢驗(yàn)，pMAL-c5X載體表達(dá)的目的蛋白易于提取，大量出現(xiàn)在上清液中；而pET32a載體表達(dá)后蛋白則基本存在于沉淀中。利用鄰苯二酚、ECG、EC 3種底物在410?nm處檢測(cè)CsPPO蛋白活性發(fā)現(xiàn)，pMALc5X-CsPPO對(duì)不同底物反應(yīng)時(shí)酶活性隨時(shí)間增加均呈現(xiàn)明顯“S”型變化，表明茶樹(shù)PPO氧化兒茶素類(lèi)的反應(yīng)并不是勻速過(guò)程。pMALc5X-CsPPO43比活力比pMALc5X-CsPPO70的高，其中pMALc5X-CsPPO43與EC反應(yīng)時(shí)酶比活力最高，最大比活力為1.45×106U·mg-1。因此，可利用pMALc5X-CsPPO43合成工業(yè)用PPO，為進(jìn)一步研究其與兒茶素的反應(yīng)機(jī)理，利用體外酶法高效獲得茶黃素奠定基礎(chǔ)。

茶樹(shù)；多酚氧化酶；原核表達(dá)；酶活性

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是存在植物體內(nèi)的一種含銅質(zhì)體金屬酶，對(duì)食品品質(zhì)風(fēng)味的形成有著重要影響[1]。根據(jù)茶葉的適制性，茶鮮葉中PPO含量越高，活性越大，越有利于紅茶品質(zhì)的形成。在紅茶初制過(guò)程中，以兒茶素為主體的多酚類(lèi)物質(zhì)，在多酚氧化類(lèi)物質(zhì)的專(zhuān)一性多酚氧化酶以及過(guò)氧化酶的催化下，可能被空氣中的氧氣氧化成醌，形成的醌再經(jīng)氧化縮合形成更為復(fù)雜的發(fā)酵產(chǎn)物如茶黃素、茶紅素和茶褐素，從而形成紅茶紅湯紅葉的品質(zhì)特征[2]。

茶樹(shù)體內(nèi)有較多PPO同工酶，不同茶樹(shù)品種與不同提取方法得到的茶樹(shù)PPO同工酶有2~10條[3-5]。茶黃素的酶促合成是獲取茶黃素的重要方法之一，但長(zhǎng)期以來(lái)多以混合酶作為酶源使用，造成生產(chǎn)中反應(yīng)條件不能固定[2]，同時(shí)，茶黃素、茶紅素等以兒茶素為底物聚合形成的分子機(jī)理也因沒(méi)有單一酶源而缺乏深入的研究。因此，如何從體外獲取高活性單一PPO酶源越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。應(yīng)用基因工程技術(shù)，構(gòu)建表達(dá)工程菌，獲得工程蛋白酶，可以獲得穩(wěn)定單一酶源，有利于茶黃素生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化。番茄、蘋(píng)果、鴨梨等物種PPO基因在大腸桿菌中已得到表達(dá)，但表達(dá)產(chǎn)物活性都非常低[6-8]。趙東等[9]首次克隆了茶樹(shù)多酚氧化酶基因，劉敬衛(wèi)、吳貽良等通過(guò)原核表達(dá)獲得了茶樹(shù)多酚氧化酶成熟蛋白[11-12]。劉敬衛(wèi)等[11]認(rèn)為在茶樹(shù)PPO原核表達(dá)中，切除轉(zhuǎn)移肽的PPO活性比全長(zhǎng)PPO活性高，轉(zhuǎn)移肽對(duì)PPO活性具有抑制作用，本研究將茶樹(shù)PPO與其他物種PPO進(jìn)行比對(duì)，擬選定兩個(gè)位置分別為第43個(gè)氨基酸和第70個(gè)氨基酸，切除轉(zhuǎn)移肽，構(gòu)建重組原核表達(dá)載體，并表達(dá)成熟PPO，探究不同位置轉(zhuǎn)移肽對(duì)PPO活性的影響。王乃棟[13]獲得了茶樹(shù)多酚氧化酶真核表達(dá)蛋白。已有研究表明，根據(jù)宿主細(xì)胞的不同，可以分為原核和真核兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)。原核表達(dá)系統(tǒng)現(xiàn)今研究得較為成熟，操作簡(jiǎn)便，表達(dá)蛋白產(chǎn)量較高，但是原核表達(dá)產(chǎn)物活性較低，可能是由于原核表達(dá)過(guò)程中誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白產(chǎn)生包涵體[10-15]。盡管通過(guò)對(duì)形成包涵體的目的蛋白復(fù)性等手段能釋放部分可溶性酶，但酶活性會(huì)受到一定程度的影響。因此，本研究嘗試?yán)每扇苄暂^大的載體pMAL-c5X，在不破壞酶本身活性的前提下，探索如何獲取可溶性高、酶活力高的PPO。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹(shù)品種“迎霜”鮮葉，2016年4月3日采摘于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所實(shí)驗(yàn)基地。取樣后立即放入液氮中冷凍，置于-80℃冰箱。

1.2 試劑

Marker、反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTMRT reagent Kit、BamH I限制性內(nèi)切酶、Xho I限制性內(nèi)切酶、Sal I限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、IPTG等藥品均購(gòu)于TaKaRa公司。EASYspin PlusRNA 提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物，E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit D2500-02，購(gòu)自O(shè)MEGA。pEASY-Blunt Simple克隆載體、Transetta(DE3)、Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于南京百斯凱科技有限公司。引物合成及測(cè)序由南京金斯瑞公司完成。

1.3 主要儀器

PCR儀（Takara，Japan），酶標(biāo)儀Thermo（MK3，Multiskan，Helsinki，F(xiàn)I），電泳儀電源（DYY-6D型，北京市六一儀器廠），水平電泳槽（DYCP-31DN型，北京市六一儀器廠），蛋白電泳槽（DYCZ-24DN型，北京市六一儀器廠），細(xì)胞破碎儀（XO-1000D型，南京先歐儀器制造有限公司），冷凍離心機(jī)（Eppendorf, GER）。

1.4 CsPPO基因的克隆

根據(jù)NCBI Gen Bank中登錄的茶樹(shù)PPO基因EU787433.1設(shè)計(jì)引物，本試驗(yàn)所需引物CsPPOF、CsPPOR見(jiàn)表1，普通PCR擴(kuò)增。

1.5 CsPPO基因轉(zhuǎn)移肽的選擇與克隆

利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST進(jìn)行同源比對(duì)分析，通過(guò)對(duì)比已知物種多酚氧化酶可變區(qū)位置，確定茶樹(shù)PPO轉(zhuǎn)移肽的位置。

表1 CsPPO原核表達(dá)引物

注：下劃線處為酶切位點(diǎn)。

Note: The underlines indicated the restriction sites.

1.6 CsPPO原核表達(dá)載體構(gòu)建

分析CsPPO基因序列、pET32a載體和pMAL-c5X載體序列，引入與pET32a載體對(duì)應(yīng)的BamH I、Xho I 酶切位點(diǎn)，與pMAL-c5X載體對(duì)應(yīng)的Sal I、BamH I酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)所需引物CsPPO43-BamH I-F、CsPPO70-BamH I-F、CsPPOXho I-R、CsPPO43-Sal I-F、CsPPO70-Sal I-F、CsPPOBamH IR（表1），具體操作方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[11]。

1.7 CsPPO融合蛋白的原核表達(dá)

將篩選出來(lái)的Rosseta-Vector-CsPPO目的菌株，在500?mL含有氨芐和氯霉素液體LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)至OD600為0.3~0.4，加入0.5?mL濃度為1?mmol·L-1IPTG 18℃過(guò)夜誘導(dǎo)培養(yǎng)20?h，離心并收集菌液。將菌體用0.01? mol·L-1pH 7的Tris-HCl緩沖溶液重懸，冰水浴超聲波破碎。取樣作為粗酶樣品，離心后分別取上清液和沉淀作為樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，SDS-PAGE電泳條件：5%濃縮膠，13%分離膠，電壓分別為100?V（濃縮膠），200?V（分離膠），上樣量20?μL。以pET32a、pMAL-c5X空表達(dá)載體表達(dá)產(chǎn)物為對(duì)照。

1.8 CsPPO酶活性測(cè)定

各酶上清液蛋白濃度測(cè)定方法采用Bradford方法。SDS-PAGE膠上蛋白條帶濃度用ImageJ計(jì)算實(shí)際蛋白含量[16]。

PPO酶活性測(cè)定方法：96孔酶標(biāo)板中加入預(yù)先混勻的150?μL 0.1?mol·L-1pH 5.6的檸檬酸鉀緩沖液及40?μL誘導(dǎo)酶的上清液，置入酶標(biāo)儀中37℃預(yù)熱20?min，分別加入10?μL 1?mg·mL-1的底物鄰苯二酚、EC、ECG。以煮沸10?min的酶蛋白液作對(duì)照。酶標(biāo)儀達(dá)到測(cè)定溫度37℃時(shí)，將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀中，在410?nm吸收波長(zhǎng)下測(cè)定反應(yīng)液的吸光值，每分鐘測(cè)定1次，共檢測(cè)1?h。酶活力單位（U）定義為：在該方法的測(cè)定條件下，反應(yīng)液的 OD410值每分鐘增加0.001為1個(gè)活力單位[17]。比活力：每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)。最大比活力：酶活力變化過(guò)程中最大斜率處的比活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsPPO轉(zhuǎn)移肽的分析與選擇

通過(guò)DNAMAN生物信息分析軟件將茶樹(shù)PPO氨基酸序列與另外11種物種進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。分別選擇第43和第70個(gè)氨基酸為轉(zhuǎn)移肽的位置（圖1）。

2.2 CsPPO原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以克隆得到的CsPPO（圖2-A）質(zhì)粒為模板，利用酶切引物擴(kuò)增出目的條帶，經(jīng)雙酶切分別得到：pET32a載體酶切產(chǎn)物5?900?bp、CsPPO43-BamH I-Xho I酶切產(chǎn)物1?668?bp、CsPPO70-BamH IXho I酶切產(chǎn)物1?599?bp（圖2-B），pMAL-c5X載體酶切產(chǎn)物5?677?bp，CsPPO43-Sal I-BamH I酶切產(chǎn)物1?668?bp、CsPPO70-Sal I -BamH I酶切產(chǎn)物1?599?bp（圖2-C）。重組質(zhì)粒后測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果與預(yù)設(shè)的序列一致，表明重組載體構(gòu)建成功，分別命名為pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70。預(yù)期蛋白分子質(zhì)量分子量分別為82、79.15、107.06、104.21?kd。

2. 3 CsPPO重組蛋白的原核表達(dá)

對(duì)pET32a、pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMAL-c5X、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70進(jìn)行IPTG低溫誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞破碎后SDS-PAGE電泳的結(jié)果顯示，粗酶中均出現(xiàn)與預(yù)期目的蛋白大小一致的條帶，而空載體則沒(méi)有出現(xiàn)此條帶（圖3），表明pET32a- CsPPO43、pET32a-CsPPO70、pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70重組質(zhì)粒成功表達(dá)。

注：圖中箭頭為轉(zhuǎn)移肽切除位置。

Note: The arrowhead in the picture is the location of the transfer peptide.

圖1 茶樹(shù)CsPPO轉(zhuǎn)移肽位置的確定

Fig. 1 Identification of the location of CsPPO transfer peptide

注：A: CsPPO（1?800?bp）；B:雙酶切產(chǎn)物：1. pET32a（5?900?bp），2. pET32a-CsPPO43（1?668?bp），3. pET32a-CsPPO70（1?599?bp）；C:雙酶切產(chǎn)物：1. pMAL-c5X（5?677?bp），2. pMALc5X-CsPPO43（1?668?bp），3. pMALc5X-CsPPO70（1?599?bp）。

注：A：pET32a原核表達(dá)結(jié)果：粗酶、上清、沉淀中3條蛋白條帶從左向右的順序一致，分別為空載體、pET32a-CsPPO43(82?kd)、pET32a-CsPPO70(79.15?kd)。B：pMAL-c5X原核表達(dá)結(jié)果：粗酶、上清、沉淀中3條蛋白條帶從左向右的順序一致，分別為空載體、pMAL-c5X、pMALc5X-CsPPO43(107?kd)、pMALc5X-CsPPO70(104?kd)。圖中箭頭指向目的蛋白。

Note: A: pET32a vector prokaryotic expression results: the sequence of the three protein bands from left to right was identical in crude enzyme, supernatant, precipitate, which were pET32a, pET32a-CsPPO43(82?kd), pET32a-CsPPO70(79.15 kd). B：pMAL-c5X vector prokaryotic expression results: the sequence of the three protein bands from left to right was identical in crude enzyme, supernatant, precipitate, which were pMAL-c5X, pMALc5X-CsPPO43(107?kd), pMALc5X-CsPPO70(104?kd). The arrow points to the target protein.

圖3 兩種載體原核表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖

Fig. 3 SDS-PAGE electrophoresis of two prokaryotic expression vectors

pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70蛋白的粗酶和沉淀中都含有目的條帶，但是上清液在電泳中未能見(jiàn)到明顯條帶，表明未能得到可溶性蛋白（圖3-A）；而pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70蛋白的粗酶、上清液、沉淀中都含有目的條帶，表明可以通過(guò)pMAL- c5X載體表達(dá)可獲得CsPPO可溶性蛋白（圖3-B）

2.4 CsPPO酶活性測(cè)定

2.4.1 以鄰苯二酚為底物CsPPO酶活性測(cè)定

CsPPO氧化鄰苯二酚反應(yīng)的酶比活力變化（圖4），在反應(yīng)1?h過(guò)程中，pMALc-5X空載體酶比活力變化微小，基本與X軸平行，pMALc5X原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO酶比活力變化均呈現(xiàn)明顯“S”型變化，0~14?min pMALc5X-CsPPO43酶比活力變化緩慢從2.2× 105U·mg-1變化到3.0×105U·mg-1，15~34? minpMALc5X-CsPPO43酶比活力變化較快，從4.25×105U·mg-1變化到3.3×106U·mg-1，35~60?min pMALc5-CsPPO43酶比活力變化又逐漸變緩，從3.3×106U·mg-1變化到4.3×106U·mg-1；0~16?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從4.2×105U·mg-1變化到5.5×105U·mg-1，變化緩慢；17~27?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力為從5.5×105U·mg-1變化到2.3×106U·mg-1，變化較明顯；28~60?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從2.3×106U·mg-1變化到2.4×106U·mg-1變化極小。pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70最大比活力分別為6.67×105U·mg-1、2.66×105U·mg-1（表2），pMALc5X- CsPPO43最大比活力約為 pMALc5X-CsPPO70的2.5倍。因SDS-PAGE中pET32a、pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70無(wú)明顯條帶，實(shí)際參加反應(yīng)的蛋白含量無(wú)法估算，用總蛋白含量粗略計(jì)算酶比活力變化。相較pET32a，pET32a-CsPPO70酶比活力變化基本與其一致，兩者變化均不顯著，基本呈現(xiàn)雙曲線變化，而pET32a-CsPPO43酶比活力變化較顯著，呈近“S”型變化，酶比活力從6.6×104U·mg-1變化到3.9×105U·mg-1（圖4）。

圖4 以鄰苯二酚為底物CsPPO酶比活力變化

表2 以鄰苯二酚為底物CsPPO酶活性測(cè)定

2.4.2 以ECG為底物CsPPO酶活性測(cè)定

CsPPO氧化ECG反應(yīng)的酶比活力變化（圖5），在反應(yīng)1?h過(guò)程中，pMALc-5X空載體酶比活力基本無(wú)變化，pMALc5X原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO酶比活力變化均呈現(xiàn)“S”型變化，0~37?min pMALc5X-CsPPO43酶比活力從6.2×105U·mg-1變化到7.4×105U·mg-1，變化較不明顯，38-55?min pMALc5X -CsPPO43酶比活力從7.4×105U·mg-1變化到2.8×106U·mg-1，變化較快，56~60?min pMALc5X- CsPPO43酶比活力從2.8×106U·mg-1變化到3.6×106U·mg-1，變化減緩。0~30?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從5.7×105U·mg-1變化到7.3×105U·mg-1，變化較微弱，31~44?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從7.3×105U·mg-1變化到1.1×106U·mg-1，變化略快，45~60?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從1.1×106U·mg-1變化到1.2×106U·mg-1，變化極微弱。pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X- CsPPO70最大比活力分別為5.78×105U·mg-1、1.08×105U·mg-1（表3），pMALc5X-CsPPO43最大比活力約為pMALc5X-CsPPO70的5.35倍。相較pET32a，pET32a-CsPPO70酶比活力變化非常小，呈現(xiàn)緩平的直線。pET32a-CsPPO43酶比活力變化略微顯著，酶比活力從8.3×104變化到1.55×105U·mg-1，呈“S”型變化（圖5）。

圖5 以ECG為底物CsPPO酶比活力變化

表3 以ECG為底物CsPPO酶活性測(cè)定

2.4.3 以EC為底物CsPPO酶活性測(cè)定

CsPPO氧化EC反應(yīng)的酶比活力變化（圖6），在反應(yīng)1?h過(guò)程中，空載體pMALc-5X酶比活力基本沒(méi)變化，pMALc5X原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO酶比活力變化均呈現(xiàn)“S”型變化，0~18?min pMALc5X -CsPPO43酶比活力變化為非常微小，酶比活力大小約為2.4×106U·mg-1，19~45?min pMALc5X-CsPPO43酶比活力從2.4×106U·mg-1變化到1.1×107U·mg-1，變化非常顯著，46~60?min pMAL c5X-CsPPO43酶比活力變化不明顯，酶比活力大小估算值約為1.1×107U·mg-1。0~20?min pMAL c5X-CsPPO70酶比活力為從6.4×105U·mg-1變化到7.0×105U·mg-1，酶比活力大小，基本保持不變，21~32?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從7.0×105U·mg-1變化到3.1×106U·mg-1，變化較為顯著，33~60?min pMALc5X-CsPPO70酶比活力從3.1×106U·mg-1變化到4.3×106U·mg-1，酶比活力變化趨于緩慢。pMALc5X-CsPPO43、pMALc5X-CsPPO70最大比活力分別為1.45× 106U·mg-1、5.73×105U·mg-1（表4），pMALc5X- CsPPO43最大比活力約為pMALc5X-CsPPO70的2.5倍。相較pET32a，pET32a-CsPPO43、pET32a-CsPPO70酶比活力變化均明顯，呈現(xiàn)出“S”型變化，0~16?min pET32a-CsPPO43酶比活力從1.6×105U·mg-1變化到1.27×105U·mg-1，酶比活力略有下降，但變化極小，17~ 49?min pET32a-CsPPO43酶比活力從1.27×105U·mg-1變化到5.42×105U·mg-1，變化較快，50-60?min pET32a-CsPPO43酶比活力變化為從5.42×105U·mg-1到5.66×105U·mg-1，酶比活力基本沒(méi)變，0~6?min從1.55×105U·mg-1到1.93×105U·mg-1，酶比活力變化較小，7~29?min從1.93×105U·mg-1pET32a-CsPPO70酶比活力變化為變化到4.45×105U·mg-1，變化略快，30~60?min酶比活力變化為從4.45×105U·mg-1到4.39×105U·mg-1，酶比活力略有下降，但變化極其微弱（圖6）。

圖6 以EC為底物CsPPO酶比活力變化

表4 以EC為底物CsPPO酶活性測(cè)定結(jié)果

3 討論

PPO不僅在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中有著重要的作用，而且在工業(yè)生產(chǎn)上也是有著非常重要的作用。茶黃素是紅茶加工中產(chǎn)生的重要色素，是由兒茶素物質(zhì)如L-EC、L-EGC、L-ECG、L-EGCG等經(jīng)PPO氧化生成，具有抑菌、抗病毒、降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化、抗突變、抗衰老、抗癌防癌等方面的作用[18]。體外酶法合成茶黃素效率并不高，這與PPO酶活性不穩(wěn)及反應(yīng)機(jī)理復(fù)雜有關(guān)，因此找到合適、穩(wěn)定的PPO酶源極為重要。目前用于茶黃素合成的PPO，一種方法是從植物體內(nèi)提取，在生產(chǎn)中往往使用粗酶，無(wú)法定性定量。另外一種方法是通過(guò)體外表達(dá)工程蛋白酶，可高效生產(chǎn)大量單一酶源，在生產(chǎn)中更具可控性。但是目前通過(guò)基因工程獲得CsPPO，酶活性較低。陳東生等[18]認(rèn)為可能是由于PPO是一種含銅質(zhì)體金屬酶，若使PPO具有活性，它需要銅離子結(jié)合并形成正確的三維結(jié)構(gòu)；而且原核表達(dá)過(guò)程中沒(méi)有翻譯后的加工過(guò)程，因此蛋白不能夠正確的折疊，從而容易形成包涵體，使酶活性降低。

本研究通過(guò)對(duì)兩種原核表達(dá)載體的構(gòu)建與誘導(dǎo)，結(jié)果表明均可成功表達(dá)CsPPO。但SDS-PAGE條帶顯示使用pET32a原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO出現(xiàn)在沉淀中，上清液中基本沒(méi)有出現(xiàn)，表達(dá)的目的蛋白可能形成包涵體，無(wú)法獲得可溶性CsPPO，與劉敬衛(wèi)等[11]研究結(jié)果相同。而pMAL-c5X原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO出現(xiàn)在上清液中，可得到可溶性CsPPO。pMAL載體都具有麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）融合體，是一種高度可溶的標(biāo)簽蛋白質(zhì)[19-20]。因此，也可以利用其進(jìn)一步純化CsPPO。

研究表明，在大腸桿菌中表達(dá)CsPPO，轉(zhuǎn)移肽會(huì)抑制活性[15]。本試驗(yàn)嘗試切除不同的轉(zhuǎn)移肽，從酶比活力結(jié)果可以看出pMAL-c5X原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO中，pMALc5X-CsPPO43比活力比pMALc5X- CsPPO70的高。利用鄰苯二酚、ECG、EC 3種底物在410?nm處檢測(cè)CsPPO蛋白活性發(fā)現(xiàn)，最大比活力分別為：6.67×105U·mg-1、5.78×105U·mg-1、1.45×106U·mg-1，可以看出在這3種底物中pMALc5X-CsPPO43與EC反應(yīng)時(shí)最大比活力最高。

另外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pET32a原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO上清液中蛋白含量太低，可能無(wú)法穩(wěn)定表現(xiàn)酶特性，與不同底物反應(yīng)時(shí)不能呈現(xiàn)出有規(guī)律的酶比活力變化趨勢(shì)。而pMAL-c5X原核表達(dá)載體表達(dá)的CsPPO在上清液中蛋白含量較高，能夠穩(wěn)定表現(xiàn)酶的特性，與不同底物反應(yīng)時(shí)酶比活力變化隨時(shí)間增加均呈現(xiàn)明顯“S”型變化，表明CsPPO氧化鄰酚類(lèi)的反應(yīng)并不是勻速過(guò)程?？赡茉?10?nm處檢測(cè)的是黃色醌類(lèi)物質(zhì)，而在形成終產(chǎn)物醌之前可能需要形成中間產(chǎn)物，當(dāng)中間產(chǎn)物達(dá)到一定濃度后，反應(yīng)才能順利進(jìn)行，表現(xiàn)為在酶比活力曲線上呈現(xiàn)出反應(yīng)前期較平緩，隨后快速升高的現(xiàn)象，因此，在CsPPO酶活性測(cè)定中不同反應(yīng)時(shí)間測(cè)定出的酶活性可能不同，可以采用酶標(biāo)儀連續(xù)測(cè)定，結(jié)果會(huì)更加準(zhǔn)確。

本研究提供一條利用pMALc5X載體獲得可溶性高、活性高的CsPPO原核表達(dá)途徑，為茶黃素體外合成奠定基礎(chǔ)，但其表達(dá)產(chǎn)物的純化、酶反應(yīng)活性變化及氧化鄰酚類(lèi)機(jī)理仍需進(jìn)一步的研究。

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Effect of Two Prokaryotic Expressed Vectors on the Activity of PPO from

GAN Yudi, SUN Kang, LI Huijuan, DU Zhongying, ZHAO Zhen, PANG Xing, LI Xinghui, CHEN Xuan*

College of Horticulture, Nangjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

To get stably soluble tea polyphenol oxidase with high activity, two vectors were selected to express CsPPO. A tea polyphenol oxidase gene was cloned from tea leaves. After trimming two peptide fragments with 43 and 70 amino acids, the sequences were connected into pET32a and pMAL-c5X vectors with BamH I/xho I and Sal I/ BamH I and named as pET32a-CsPPO43, pET32a-CsPPO70, pMALc5X-CsPPO43and pMALc5X-CsPPO70respectively. After expressed of recombinant plasmids in theTransetta (DE3) strain, SDS-PAGE results showed that the protein expressed by pMAL-c5X was easier extracted than that by pET32a. The proteins expressed by pMAL-c5X were found in both the supernatant and pellet, while those by pET32a were only found in the pellet. The activity of CsPPO was detected by 1,2-benzenediol, ECG and EC as substrates in 410 nm with micro-plate reader. The ‘S’ shaped curves graphed with three substrates oxidized by the pMALc5X-CsPPO indicated that all reaction speeds were not constant. The specific activity of pMALc5X-CsPPO43was higher than that of pMALc5X-CsPPO70, with the highest activity reaching 1.45×106U·mg-1when reacted to EC. Therefore, pMALc5X-CsPPO43could be used to synthesize industrial PPO, but its role in catechin mechanism still needs further research.

, polyphenol oxidase, Prokaryotic expression, enzymatic activity

TS272.2；Q52

A

1000-369X(2018)04-396-10

2018-04-04

2018-04-26

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金（CARS-19）、國(guó)家自然科學(xué)基金（31470690）、江蘇省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（sxgc2017223）、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)SRT項(xiàng)目（1614C12）

甘玉迪，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)遺傳育種和茶葉生化研究。*通訊作者：chenxuan@njau.edu.cn