吳紹長, 劉 奕, 申子好

(1. 麗水市第二人民醫(yī)院, 麗水 323000; 2. 杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司， 杭州 310052)

交互反應(yīng)DNA結(jié)合蛋白43 ku(Transactive response DNA-binding protein of 43 ku，TDP-43)是一個(gè)多功能的DNA和RNA結(jié)合蛋白，在細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮功能[1-3]。TDP-43和其它神經(jīng)變性疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)現(xiàn)在被認(rèn)為朊病毒，與多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，如額顳性癡呆(Frontotemporal Lobar degeneration，F(xiàn)TLD)、阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)、Pick′s病、包涵體肌炎(Inclusion body myositis，IBM)、肌肉縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)[4-12]。本實(shí)驗(yàn)利用重組TDP-43蛋白免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，制備TDP-43單克隆抗體(簡稱單抗，McAb)，并進(jìn)行純化和效價(jià)測定，以期為建立TDP-43的檢測、純化方法以及開發(fā)相應(yīng)的檢測試劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

SPF級BALB/c 小鼠，雌性，6～8周及12周以上，購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室；NS-1骨髓瘤細(xì)胞由浙江大學(xué)細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)室提供；重組TDP-43蛋白由杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司提供。弗氏完全佐劑(Complete Freund′s Adjuvant，CFA)、弗氏不完全佐劑(incomplete Freund′s adjuvant，IFA)、蛋白A親和層析柱、PEG 3000、PEG 20000、HT、HAT、RPMI-1640 培養(yǎng)基、HRP-羊抗鼠IgG、小鼠單抗分型試劑盒、Penicillin-Streptomycin均購自Sigma公司；新生牛血清購自Gibco公司；嬰兒油購自強(qiáng)生公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱(日本三洋MCO-18AIC)；倒置生物顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠37XE-PC)；凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備SW-CJ-1FD)；酶標(biāo)儀(Tecan infinite F50)；紫外可見分光光度計(jì)(上海尤尼克儀器WFZ UV-2100)；離心機(jī)(長沙湘智離心機(jī)儀器TGL-20MB)；恒溫振蕩器(金壇市華城高爾實(shí)驗(yàn)儀器THZ-82)；洗板機(jī)(深圳市匯松科技PW-960)；精密電子天平(METILER TOLEDO AL104)；旋轉(zhuǎn)混勻儀(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器MX-RL-E)；磁力攪拌器(德國IKA RH B 2 S25)；pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器PHS-3C)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)HPX-9082 MBE)；超低溫冰箱(海爾DW-S6L388A)。

1.3 方法

1.3.1 制備雜交瘤細(xì)胞

1)免疫BALB/c 小鼠。

①第1次免疫：在100 μL 0.5 mg/mL 重組TDP-43蛋白中加入CFA 100 μL進(jìn)行乳化，用上述乳化液免疫6～8周齡小鼠。

②第2次免疫：完成第1次免疫的2～3周后，在100 μL 0.5 mg/mL 重組TDP-43蛋白中加入IFA 100 μL進(jìn)行乳化，用上述乳化液第2次免疫上述6～8周齡小鼠。

③第3次免疫：完成第2次免疫的2～3周后進(jìn)行第3次免疫。方法同第2次免疫。第3次免疫完成后的第10天進(jìn)行尾部靜脈取血。

2)測定抗體滴度。用1 μg/mL的抗原溶液包被96孔酶標(biāo)板；將1∶100的小鼠血清在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行倍比稀釋，測定小鼠血清中的抗體滴度，篩選血清抗體滴度達(dá)到1∶10 000以上的小鼠用于的細(xì)胞融合。

3)細(xì)胞融合。取出免疫小鼠的脾臟，在無菌的組織培養(yǎng)皿中加入4 mL細(xì)胞培養(yǎng)液(含1.64%RPMI 1640、0.2% NaHCO3、1% Penicillin-streptomycin、10%滅活新生牛血清)，將脾臟放入上述組織培養(yǎng)皿中打碎；將NS-1骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞在50 mL離心管中按1∶10的比例混合后，1500 r/min離心5 min，去上清液后慢慢加入1 mL 50% PEG 3000；用RPMI1640培養(yǎng)基洗去PEG 3000；采用半膠質(zhì)培養(yǎng)基克隆法篩選雜交瘤細(xì)胞；在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞(37℃，5%CO2)；培養(yǎng)3 d后用間接ELISA 法篩選陽性生長的細(xì)胞克隆孔，有限稀釋法進(jìn)行克隆及亞克隆。

1.3.2 制備單克隆抗體

1)雜交瘤細(xì)胞的體內(nèi)培養(yǎng)。對2只BALB/c小鼠(12周以上)的腹腔注射嬰兒油(0.5 mL/只)；2周后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞液1 mL/只，注射10 d左右可見小鼠腹腔明顯變大，收集小鼠腹水。

2)單克隆抗體的純化：將經(jīng)過脫脂棉過濾后的小鼠腹水與等量的吸附緩沖液(pH 9.0)混勻，并加到已經(jīng)經(jīng)過吸附緩沖液(pH 9.0)預(yù)處理的蛋白A柱上，收集濾過液；將收集到的濾過液再次加到蛋白A柱上；用足夠量的吸附緩沖液洗柱；在蛋白A柱上加上洗脫緩沖液(pH 3.0)，用一系列按順序編好號的小試管(每個(gè)試管中加入200 μL 0.25 mol/L Na2PO4)收集洗脫液，每管收集約2 mL，測定每管收集到的洗脫液的蛋白含量，直到蛋白含量接近“0”時(shí)停止收集；將蛋白含量較多的試管中的洗脫液全部匯集到一起并混勻。

3)單克隆抗體濃縮。將純化好的單抗溶液裝入透析袋中，將吸水劑PEG 20000撒在透析袋周圍，室溫下靜置4 h以上使溶液中的水分滲出；用Lowry 法測其蛋白濃度。

1.3.3 Ig類與亞類的鑒定

采用小鼠單抗分型試劑盒進(jìn)行鑒定，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.4 單克隆抗體效價(jià)測定

將濃縮后的抗體按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000稀釋后，加入以重組TDP-43蛋白包被的酶標(biāo)板中，通過間接ELISA 法測定其A450 nm值，以稀釋度對A450 nm值畫折線圖，取A450 nm值為0.1時(shí)的稀釋度為其效價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細(xì)胞的制備

雜交瘤細(xì)胞的抗體陽性檢出率為8.33% (48/576)，選擇其中較高讀數(shù)的3株進(jìn)行克隆和亞克隆，最終獲得2株分泌抗TDP-43單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2A5和1C5。TDP-13的序列示意圖如圖1，2A5是針對TDP-43蛋白13～123位序列的單克隆抗體，可以檢測TDP-43和TDP-35(圖中86～414位)；1C5是針對TDP-43蛋白403～413位序列的單克隆抗體，可以檢測TDP-43和TDP-35和TDP-25(圖中的216～414位)。

圖1 TDP-43序列示意圖

2.2 Ig類/亞類的鑒定

經(jīng)檢測，2A5和1C5均為IgG1類免疫球蛋白(圖2)。

圖2 2株單抗的Ig分型

2.3 蛋白濃度和抗體效價(jià)

用Lowry 法測定1C5抗體濃度為1.5 mg/mL，2A5為2.0 mg/mL。

1C5抗體和2A5抗體的效價(jià)分別約為1∶256 000和1:512 000(表1)。

表1 2株抗人TDP-43單克隆抗體的效價(jià)測定

3 討論與結(jié)論

TDP-43是一種主要在細(xì)胞核表達(dá)的DNA和RNA結(jié)合蛋白，由414個(gè)氨基酸組成，分子量約為43 ku[10-12]。TDP-43屬于異種的核糖核蛋白家族，在細(xì)胞內(nèi)的RNA轉(zhuǎn)錄、選擇性剪接及mRNA穩(wěn)定性調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮功能。在肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)和額顳葉變性(Frontotemporal lobar degeneration，F(xiàn)TLD)病人脊髓或大腦受損區(qū)域的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中，能檢測到泛素化的蛋白質(zhì)包涵體，TDP-43是其特征性成分[12]。在家族性或散發(fā)性ALS病例中，已鑒定出30多個(gè)TDP-43的突變，它們多集中于該蛋白C端的甘氨酸富集區(qū)。到目前為止，TDP-43形成蛋白質(zhì)聚集體的機(jī)制及其與神經(jīng)退行疾病的關(guān)系尚不清楚。此外，TDP-43的病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)它還存在于很多其他神經(jīng)退行性疾病中，包括tau病理相關(guān)疾病，如Pick′s病、阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease, AD)等[4-12]。為了深入研究TDP-43蛋白在上述退行性疾病中的作用，本研究制備了抗人TDP-43單克隆抗體。

單克隆抗體具有高度均一、生物活性單一和與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)作為重要工具廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域[13-15]。本研究在傳統(tǒng)的單克隆抗體制備過程中采用自行優(yōu)化的半膠質(zhì)培養(yǎng)基克隆法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)，此方法避免了傳統(tǒng)方法在選擇性培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞時(shí)需要多次更換培養(yǎng)基的過程，簡化了操作流程，并降低了操作過程中造成污染的風(fēng)險(xiǎn)。利用該技術(shù)成功制備出2株穩(wěn)定分泌抗人TDP-43單克隆抗體細(xì)胞株1C5和2A5，其亞類均為IgG1。Kwong等[16]制備得到的18株抗人TDP-43單克隆抗體中有9株的亞類為IgG1，有8株的亞類為IgG2a，1株的亞類為IgG2b。通過間接ELISA鑒定，1C5抗體和2A5抗體的效價(jià)分別約為1∶256 000和1∶512 000，說明此兩株單抗具有較高的生物活性，可用于檢測TDP-43蛋白的各種免疫學(xué)方法的建立，為建立人TDP-43蛋白的檢測、純化方法以及開發(fā)相應(yīng)的檢測試劑奠定了基礎(chǔ)。