王 霞, 陳慧澤, 李永峰, 韓 榕, 陳 惠

(山西師范大學 生命科學學院， 臨汾 041004)

鹽節(jié)木(Halocnemumstrobilaceum)是藜科(Chenopodiaceae)鹽節(jié)木屬(Halocnemum)的一種耐鹽半灌木植物，植株較小且肉質(zhì)化,多分布于鹽堿地區(qū)[1]。鹽節(jié)木主要生長在我國新疆和甘肅等北部地區(qū)，為耐鹽耐旱的植物類群[1-2]。目前，關于鹽節(jié)木的研究多集中在種子的萌發(fā)與幼苗生長的影響[1,3]、群落特征、提取和開發(fā)植物次生代謝產(chǎn)物類物質(zhì)[4-5]等方面。近年來，還進行了鹽節(jié)木耐鹽基因的克隆和表達[6]、組織培養(yǎng)快速繁殖[7]及鹽促進根伸長的機制等的研究[8],但其基因組大小的研究還未見報道。甜菜(Betavulgaris)同鹽節(jié)木一樣，也屬藜科(Chenopodiaceae)，二年生草本植物，物種為二倍體，體內(nèi)含18條染色體[9]。

基因組的大小(又稱C值，)是指一個物種單倍體核DNA的含量，單位以質(zhì)量(pg)或是堿基對數(shù)目(Mbp)表示,其換算關系為1 pg=978 Mbp或1 Mb=1.022×10-3pg[10]。物種基因組大小的測定，為分子與細胞遺傳、植物的基因組學及其親緣進化關系研究提供了重要的基礎資料[11]。

早期的流式細胞儀主要用于動物實驗研究上，用來測定植物細胞DNA含量的出現(xiàn)較晚。流式細胞儀可對樣品進行自動測定分析，檢測器捕捉樣品懸浮液中被染色的細胞核所激發(fā)后的熒光信號，通過隨機軟件自主設計參數(shù)要求進行量化分析，比較待測樣品和內(nèi)參樣品的相對熒光強度從而計算出DNA含量[12]。流式細胞術(shù)測定基因組大小的制樣方法簡便，檢測結(jié)果較為可靠穩(wěn)定，該方法目前已廣泛應用于生物等領域的研究。

本研究用Otto裂解液獲取兩種植物葉片的單細胞懸浮液，以藜科甜菜屬植物甜菜(Betavulgarisssp.vulgaris，758 Mbp,NCBI at http://WWW.ncbi.nlm.nih.gov/)作為內(nèi)參植物，用流式細胞儀對每個樣品進行上樣測定。通過比較,計算出鹽節(jié)木基因組的大小，為物種鑒定、分類研究及鹽節(jié)木的基因組測序研究提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鹽節(jié)木種子(采自新疆古爾班通古特沙漠南緣五家渠市蔡家湖鹽節(jié)木自然分布的群落中)；甜菜種子(購自騰輝種業(yè)公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 植株培養(yǎng)

取甜菜種子，冷水浸泡過夜后，播種于蛭石∶營養(yǎng)土=1∶1的營養(yǎng)砵中。鹽節(jié)木種子經(jīng)70%乙醇和0.1%升汞分別消毒1 min和8 min及無菌水沖洗3～4次后，無菌紙吸干水分后接種培養(yǎng)在MS基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2個月后，從培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)砵中(蛭石∶營養(yǎng)土=1∶1)再培養(yǎng)2～3個月。培養(yǎng)條件見遆衛(wèi)國等[7]、房娟娟等[8]的研究。

1.2.2 鹽節(jié)木與甜菜細胞大小觀察

為了確定兩種樣品的取材量和流式上樣量，特觀察了兩種植物葉片的細胞大小。方法為徒手切片法，分別取干凈的鹽節(jié)木同化枝與甜菜嫩葉，用單面刀片切取厚為0.1 mm的薄片，置于干凈載玻片上，滴加一滴蒸餾水，蓋上蓋玻片，在Olympus(CX21FS1)顯微鏡下觀察二者細胞的大小并攝片。

1.2.3 基因組大小的測定

1)細胞懸浮液的制備。鹽節(jié)木同化枝與甜菜嫩葉細胞核懸浮液的制備參考Dolezel等[13]的方法，并進行優(yōu)化和調(diào)整。稱取鹽節(jié)木同化枝300 mg，在滴有1 mL的OttoⅠ(100 mmol/L檸檬酸，0.5%(V/V)吐溫-20，pH 3.0，0.22 μm孔濾膜過濾，4℃保存)的預冷培養(yǎng)皿中，用單面刀片快速將鹽節(jié)木同化枝切成約1 mm厚的薄片，冰上孵育5 min后400目尼龍網(wǎng)過濾到離心管中，1000 r/min離心5 min，用移液槍棄去上清，收集沉淀細胞，再加入100 μL OttoⅠ置于4℃環(huán)境中備用。采用同樣方法制備內(nèi)參植物甜菜和二者混合樣品的細胞懸浮液。

2)DNA特異染色。向制備好的100 μL細胞懸浮液中各加入280 μL的OttoⅡ(400 mmol/L十二水合磷酸氫二納，pH 8.0，0.22 μm 微孔濾膜過濾，常溫避光保存)，60μL碘化丙啶(PI,1mg/mL，0.22μm水系微孔濾膜過濾，)和60 μL RNase(1 mg/mL，預先煮沸，0.22 μm水系微孔濾膜過濾，)，輕微搖晃，避光染色10 min后上機檢測。

3)流式細胞儀檢測。流式細胞儀(BD FACSCCalibur,USA)開機預熱30 min，利用488 nm的氬離子激發(fā)光，檢測PI的熒光強度，每個樣品重復測定6次，每次至少獲取一萬個細胞。用隨機軟件Modfit LT(Mac for version3.0)進行數(shù)據(jù)整理和分析，變異系數(shù)控制在6%以下。所測樣品的DNA含量均是以甜菜的DNA含量為標準的相對值。根據(jù)公式P=F1/F2H(P為待測樣品的DNA含量，F(xiàn)1為待測樣品的熒光強度，F(xiàn)2為內(nèi)參樣品的熒光強度，H為內(nèi)參樣品的DNA含量)可計算出待測樣品的DNA含量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽節(jié)木與甜菜細胞大小的觀察

由徒手切片制片觀察如圖1所示，鹽節(jié)木同化枝與甜菜嫩葉二者細胞的大小差異不大，所以研究過程中兩種材料的葉片均稱取相同重量，來獲得樣品的細胞核懸浮液，同時在流式細胞儀上樣量方面也保持鹽節(jié)木與甜菜取樣量一致。

圖1 鹽節(jié)木與甜菜細胞大小觀察(a)甜菜;(b)鹽節(jié)木Fig 1 The cell size observation of Halocnemum strobilaceum and Beta vulgaris (a)Beta vulgaris;(b)Halocnemum strobilaceum

2.2 鹽節(jié)木、甜菜細胞懸浮液碘化丙啶染色分析

實驗材料均在OttoⅠ裂解液中進行破碎并分離獲得完整的細胞核，OttoⅠ裂解液中的0.5%(V/V)Tween-20具有促進作用，能夠獲得更多的細胞核。碘化丙啶為常用的核酸染料，最大吸收峰在488 nm處，研究用碘化丙啶較另一種核染料DAPI相比，更適合本次流式細胞儀的測定結(jié)果。實驗用了60 μg/500 μL的碘化丙啶，流式分析參數(shù)設為FL2-A,儀器檢測樣品出峰快、穩(wěn)定且粒子清晰集中。

2.3 鹽節(jié)木、甜菜基因組大小分析

用碘化丙啶標記的實驗樣品核DNA，在流液系統(tǒng)中通過激光照射，會產(chǎn)生熒光信號。其中散射光的強度和空間分布與細胞的形態(tài)、大小、膜及細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關，熒光強弱與樣品核DNA含量成正比。熒光信號經(jīng)光電倍增管接收，轉(zhuǎn)換為電信號和可被計算機識別的數(shù)字信號，可通過計算機隨機軟件顯示并進行量化分析，因此能用于測定生物的基因組大小[15]。儀器測定的精確度由G0/G1期峰的變異系數(shù)CV來反映，CV%=(SD/mean)×100%，本實驗的變異系數(shù)控制在6%以下，結(jié)果可靠。實驗測定結(jié)果的圖像如圖2所示。通過G0/G1期峰值比較發(fā)現(xiàn)，即熒光道數(shù)峰值比，鹽節(jié)木基因組是甜菜基因組的0.875倍，由此計算出鹽節(jié)木基因組的大小為 663.25 Mbp,或相對DNA含量為0.678 pg。研究為后續(xù)分子和基因組等相關方面奠定了基礎。

圖2 流式散點圖和直方圖Fig 2 Subcellar scatter plots and histograms by FCM (a,b,d,e,g,h)The subcellar scatter plots;(c,f,i)The histogrms;(a,b,c)Beta vulgaris;(d,e,f)Halocnemum strobilaceum;(g,h,i) The mixed samples

a、b、d、e、g、h：散點圖;c、f、i：直方圖。a、b、c：甜菜;d、e、f：鹽節(jié)木;g、h、i：混合樣圖

3 討論

目前，常規(guī)用來測定基因組大小的方法有顯微分光光度法，孚爾根光密度測量法和流式細胞術(shù)。其中因流式細胞術(shù)制樣簡便，檢測速度快且較為準確等優(yōu)點，已被廣泛用于測定物種的基因組大小。但由于不同研究者所采用儀器、裂解液、材料類型、測定方法、參數(shù)設計及控制等因素上的差異，同一物種的基因組大小的檢測結(jié)果可能會稍有差異[16]。流式細胞術(shù)分析中，合適裂解液的選擇對實驗結(jié)果有明顯的影響。受裂解液各自化學成分差異、植物組織細胞的多樣性等影響，不同裂解液對不同材料的裂解效果有很大的差異。Loureiro等[17]在植物上比較了4種不同細胞裂解液的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Otto′s的裂解效果較好，因此本研究也參照選用了Otto作為細胞裂解液，且經(jīng)實驗證實，適合作為本研究的裂解液使用。其次，內(nèi)參物種的選擇對物種基因組大小的測定也有影響。Bennelt等[18]認為內(nèi)參選擇時，要考慮兩種物種基因組大小的差異，差值太大或太小都不利于流式測定，且要有穩(wěn)定遺傳性等條件。同時在進行植物基因組大小測定時，應盡量選用植物材料，而非動物材料作為內(nèi)參，以減少實驗誤差。我們選擇甜菜作為內(nèi)參是因為甜菜與鹽節(jié)木同屬于藜科植物，親緣關系比較近，推測基因組大小也相近。研究結(jié)果表明：二者基因組大小的確相近，甜菜的基因組大小為758 Mbp,鹽節(jié)木的基因組大小為663.25 Mbp，鹽節(jié)木的基因組比甜菜的基因組小94.75 Mbp。

在流式細胞儀的結(jié)果分析中，樣品的前期處理，可保證分析結(jié)果的準確性和精確度。本研究選用了嫩的鹽節(jié)木同化枝，取材后立即制樣、染色及檢測，進而保證了樣品的活性，同時確定了本實驗合理的離心轉(zhuǎn)速為1000 r/min，獲得了較為純凈的單細胞懸浮液，儀器檢測的樣品峰圖良好。而CV值作為檢驗實驗精度的一個標準，本研究在一系列條件的控制下，實驗樣品的CV值均在6%以下。