楊卓茹， 張敏敏， 蔡汝潔， 張含笑， 管俊豪， Altaf Ahmed Simair， 陸昌瑞

(東華大學(xué) 化學(xué)化工與生物工程學(xué)院, 上海 201620)

端粒酶是一類獨(dú)特的核糖核蛋白復(fù)合體，主要負(fù)責(zé)保護(hù)染色體末端端粒的完整性和穩(wěn)定性[1-6]。端粒酶包含兩個(gè)主要部分：蛋白催化亞基端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)和RNA亞基(TR)。不同物種的端粒酶TR在大小和序列上均有差異[7]，根據(jù)野生型和突變型TR的二級(jí)結(jié)構(gòu)系統(tǒng)發(fā)育比較揭示了已發(fā)現(xiàn)的所有物種中都存在兩個(gè)催化功能區(qū)域：template/pseudo-knot (t/PK，core 結(jié)構(gòu)域)結(jié)構(gòu)域、CR4/5結(jié)構(gòu)域[8]。t/PK結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)模板和一個(gè)封閉的、帶有保守嘧啶三重螺旋的假結(jié)結(jié)構(gòu)[9-11]，CR4/5結(jié)構(gòu)域主要與TERT的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(TRBD)連接，刺激端粒酶催化活性[12]。在已發(fā)現(xiàn)的物種中，CR4/5結(jié)構(gòu)域通常含有催化作用的一個(gè)三通結(jié)構(gòu)，由莖P5，P6、莖環(huán)P6.1和內(nèi)部環(huán)組成。而hTR除了這部分結(jié)構(gòu)以外，還有一個(gè)由P6額外的螺旋P6b擴(kuò)展形成的線性P6a-P6b結(jié)構(gòu)[13]，但P6b不是端粒酶催化活性所必須的[10]，所以本實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)序列時(shí)，只保留了對(duì)端粒酶有催化活性的部分。然而，現(xiàn)階段RNA的功能研究很少，運(yùn)用結(jié)構(gòu)生物學(xué)來(lái)進(jìn)行研究RNA的功能將顯得尤為重要。目前只有四膜蟲(chóng)和青鳉[14]的CR4/5結(jié)構(gòu)域已經(jīng)被解析出來(lái)，而hTR CR4/5的結(jié)構(gòu)研究遇到了瓶頸，至今三維結(jié)構(gòu)仍沒(méi)有解析出來(lái)。

隨著同步輻射光源的發(fā)展，X射線小角散射(SAXS)技術(shù)應(yīng)用越來(lái)越廣泛。相比于X射線晶體衍射，SAXS的樣品為溶液，不需要結(jié)晶且時(shí)間短，因此利用SAXS技術(shù)解析生物大分子結(jié)構(gòu)變得非常有意義。SAXS[15-17]是目前發(fā)展最快的一種探究生物大分子三維結(jié)構(gòu)的技術(shù)，其原理是當(dāng)X射線照射到樣品上時(shí)，如果樣品內(nèi)部存在納米尺度的電子密度不均勻區(qū)，則會(huì)在入射光束周圍的小角范圍出現(xiàn)散射X射線的現(xiàn)象。SAXS不僅能夠提供生物大分子的低分辨率三維結(jié)構(gòu)信息，而且還可以用于動(dòng)態(tài)學(xué)方面的研究。因此，作者采用SAXS技術(shù)并成功解析了hTR CR4/5在溶液中的構(gòu)象。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

hTR CR4/5重組質(zhì)粒由上海生工生物公司合成。NTP，dNTP，甲酰胺購(gòu)于生工生物；Taq酶及T7酶由本實(shí)驗(yàn)室自己制備；spermine購(gòu)于sigma生物公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器：離心機(jī)，凝膠成像儀(BIO-RAD)，電泳儀(BIO-RAD)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hTR CR4/5原始序列的基因設(shè)計(jì)

在設(shè)計(jì)hTR CR4/5序列時(shí)保留了P5、J5/6、J5/6.1、P6.1、P6a，去掉了P6b，在第266個(gè)和第291個(gè)核苷酸之間用GAAA序列連接起來(lái)形成一個(gè)loop環(huán)。修改后的hTR CR4/5重組質(zhì)粒由上海生工生物公司合成。

1.2.2 hTR CR4/5體外轉(zhuǎn)錄及RNA的純化

首先，目的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得足量的PCR產(chǎn)物，然后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(TCX)實(shí)驗(yàn)獲得RNA產(chǎn)物，最后用12%的變性聚丙烯酰胺凝膠以及后續(xù)的離心濃縮來(lái)獲得目的RNA。

1.2.3 hTR CR4/5的SAXS方法

利用上海蛋白質(zhì)同步輻射光源(五站六線)BL19U2站線進(jìn)行散射，制備不同濃度的hTR CR4/5樣品和相應(yīng)的緩沖液放入儀器中，使用 RAW完成從2D圖像到1D數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)換工作，Primusqt對(duì)1D數(shù)據(jù)的處理，最后利用Dammin進(jìn)行3D建模。

2 結(jié)果

2.1 hTR CR4/5的PCR結(jié)果

圖1為50 μL體系RCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從結(jié)果來(lái)看，沒(méi)有拖尾、沒(méi)有非特異性及其他雜帶，在進(jìn)行PCR條件優(yōu)化后就可用于體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

圖1 hTR CR4/5的 PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1%瓊脂糖凝膠)

M：DNA marker；泳帶1：hTR CR4/5質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物

2.2 hTR CR4/5的體外轉(zhuǎn)錄及純化結(jié)果

運(yùn)用文獻(xiàn)[18]的體外轉(zhuǎn)錄體系后，發(fā)現(xiàn)目的基因的濃度較低。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)體外轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行了優(yōu)化，并發(fā)現(xiàn)增大NTP和Mg2+含量能有效地提高目的基因的濃度。根據(jù)體外轉(zhuǎn)錄，hTR CR4/5條帶能夠被HDV核酶完全剪切，并且hTR CR4/5的濃度也較高。切下的目的基因條帶經(jīng)離心濃縮后得到目的RNA。從圖2可以看出，在hTR CR4/5稀釋100倍后條帶依然清晰，無(wú)降解，測(cè)定RNA濃度為2.6 mg/mL。

圖2 hTR CR4/5純化結(jié)果(12%變性聚丙烯酰胺凝膠)

M：RNA marker, 泳帶1：純化后的hTR CR4/5(稀釋 50倍)；泳帶2：純化后的hTR CR4/5(稀釋100倍)

2.3 hTR CR4/5 的SAXS結(jié)果

從不同濃度(3.1、4.3、6.8和10.5 mg/mL)的hTR CR4/5和相應(yīng)緩沖液的SAXS結(jié)果(圖3-A)可以看出，有一個(gè)樣品(紫紅色曲線)與其他3個(gè)樣品曲線不同，造成這種結(jié)果的原因可能是樣品中有氣泡或者樣品濃度太高。之后我們進(jìn)行強(qiáng)化歸一，從扣除緩沖液后的散射結(jié)果(圖3-B)可以看出棕色曲線的頭部波動(dòng)較大。出現(xiàn)這種結(jié)果的原因是由于樣品的濃度太高，于是在后面的數(shù)據(jù)處理時(shí)，放棄了樣品濃度最高的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對(duì)其他3組不同濃度的樣品進(jìn)行散射后作Guinier圖，結(jié)果(圖3-C)顯示當(dāng)hTR CR4/5濃度為4.3 mg/mL時(shí)散射曲線和理論值可以完全重合。之后再進(jìn)行Dammif分析并調(diào)整不同的Dmax值，結(jié)果(圖 3-D)顯示實(shí)驗(yàn)值與理論值疊加后具有很好的吻合度。同時(shí)，可以看出計(jì)算得到的P(r)值(圖3-E)在大r區(qū)域與橫坐標(biāo)結(jié)合處較平緩，這說(shuō)明得到的數(shù)據(jù)具有很好的可靠性。最后利用晶體結(jié)構(gòu)擬合hTR CR4/5的SAXS數(shù)據(jù)。

圖3 hTR CR4/5的SAXS數(shù)據(jù)處理

A： 對(duì)不同濃度的hTR CR4/5和緩沖液進(jìn)行數(shù)據(jù)平均的結(jié)果。B：扣除緩沖液后不同濃度的hTR CR4/5的散射結(jié)果。C：Guinier 分析，從第 40 到第 110 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行分析，并計(jì)算Rg值為24.86。D：Dammif值分析，調(diào)整 Dmax值，使散射曲線與理論曲線重合。E：GNOM分別從殘差、系統(tǒng)誤有效性穩(wěn)定性等進(jìn)行評(píng)估得到的P(r)值

2.4 端粒酶RNA(TR) CR4/5基因序列比對(duì)及hTR CR4/5的溶液構(gòu)象模型

由于SAXS具有一定的局限性，為進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們將人、青鳉、小鼠、四膜蟲(chóng)的TR CR4/5基因序列進(jìn)行了比對(duì)。結(jié)果(圖4-A)發(fā)現(xiàn)人和小鼠基因序列相似度達(dá)到99%，其次是青鳉，黑色字體堿基是4種物種共同具有的序列。通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖4-B)，推測(cè)人、小鼠、青鳉應(yīng)具有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)及生化功能。

通過(guò)SAXS模擬了hTR CR4/5在溶液中的構(gòu)象(圖5-A)，得到形狀似“L”型的模型。經(jīng)同源序列比對(duì)得知，人和小鼠的TR CR4/5同源性最高，但小鼠TR CR4/5結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)至今未解析出來(lái)。所以我們采用了青鳉TR CR4/5的晶體結(jié)構(gòu)(圖5-B)與hTR CR4/5的SAXS模型進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)青鳉TR CR4/5可以擬合到hTR CR4/5的模型中(圖5-C)。從擬合的模型中看出人與青鳉TR CR4/5結(jié)構(gòu)的最大區(qū)別是hTR CR4/5的內(nèi)部環(huán)(CUGGAGGCGUCAGCC)要比青鳉(GCGUU)的大很多，相當(dāng)于圖5-C中紅色圓內(nèi)的那部分結(jié)構(gòu)。而其他區(qū)域(P6.1/P5/P6)的位置大致相同。這能夠?yàn)閔TR CR4/5結(jié)構(gòu)域和hTR晶體結(jié)構(gòu)的解析提供相關(guān)的理論數(shù)據(jù)。

圖4 不同物種TR CR4/5的基因序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

A：分別對(duì)人、青鳉、小鼠、四膜蟲(chóng)進(jìn)行序列比對(duì)，黑色堿基為4種物種有相同的堿基，紅色為不同堿基，人和小鼠的藍(lán)色堿基相同；B： 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 hTR CR4/5的SAXS結(jié)構(gòu)模型

A： hTR CR4/5的SAXS結(jié)構(gòu)模型；B: 青鳉的TR CR4/5三維結(jié)構(gòu)；C: 青鳉的TR CR4/5 P6區(qū)域與hTR CR4/5 P6a區(qū)域的擬合三維結(jié)構(gòu)模型，其中兩物種最大的區(qū)別是內(nèi)部環(huán)的大小即圖中紅色圓區(qū)域

3 結(jié)論

SAXS是目前發(fā)展最快的一種解析生物大分子結(jié)構(gòu)的技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)選取hTR CR4/5為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄和RNA的純化過(guò)程，探究了用于SAXS的最佳RNA濃度，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)hTR CR4/5濃度為4.3 mg/mL時(shí)，所得SAXS數(shù)據(jù)最優(yōu)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SAXS結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)各物種間TR CR4/5的同源序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)人和小鼠的CR4/5同源性最高，但由于人和小鼠的CR4/5結(jié)構(gòu)都未解析出來(lái)，所以挑選了具有較高同源性的青鳉TR CR4/5與hTR CR4/5結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了擬合，發(fā)現(xiàn)青鳉TR CR4/5可以嵌入到hTR CR4/CR5的模型中。最后分析預(yù)測(cè)了hTR CR4/5結(jié)構(gòu)域各區(qū)域的大體位置，推測(cè)hTR CR4/5和青鳉TR CR4/5在功能上具有相似性。本結(jié)果將為hTR CR4/5和hTR晶體結(jié)構(gòu)解析提供寶貴的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。