侯琪琪, 于 倩, 李 泉, 李榮貴, 秦 松, 葛保勝

(1. 青島大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 青島 266071; 2.中國(guó)石油大學(xué)(華東)生物工程與技術(shù)中心, 青島 266555; 3. 中國(guó)科學(xué)院 煙臺(tái)海岸帶研究所, 煙臺(tái) 264003)

LHCⅡ(Light harvesting complex Ⅱ)是植物光合系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中的一類重要的捕光色素-蛋白復(fù)合物，又稱捕光天線復(fù)合物，是類囊體膜蛋白中含量最豐富的蛋白，約占類囊體膜蛋白總數(shù)的30%，結(jié)合葉綠體中大約50%的葉綠素[1]。據(jù)報(bào)道，一個(gè)LHCⅡ分子可以結(jié)合14個(gè)葉綠素分子，其中包括8個(gè)葉綠素a和6個(gè)葉綠素b[2]。葉綠素a/b的選擇性結(jié)合主要取決于其結(jié)合位點(diǎn)周圍氫鍵供體的性質(zhì)，如LHCⅡ的葉綠素結(jié)合位點(diǎn)周圍的谷氨酰胺側(cè)鏈酰胺基可以作為供體，與葉綠素b的C7-甲酰基形成氫鍵，而亮氨酸的非極性側(cè)鏈更適合與葉綠素a分子的C7-甲基結(jié)合[3]。

研究表明，在植物光合系統(tǒng)中的色素-蛋白復(fù)合物能夠高效捕獲太陽能，并將其通過光合作用轉(zhuǎn)化為化學(xué)能[4]。隨著染料敏化太陽能電池的深入研究，生物基的染料敏化太陽能電池凸顯出更多的優(yōu)勢(shì)，如捕光效率高、天然無污染等[5]。同時(shí)，捕光天線復(fù)合物還能夠在弱光條件下吸收光能，然后由天線復(fù)合物吸收的光能又轉(zhuǎn)移到光反應(yīng)中心PSⅠ或者PSⅡ[6-8]。PSⅡ中的捕光復(fù)合物L(fēng)HCⅡ在光能向PSⅡ或者PSⅠ的轉(zhuǎn)移過程中起到了關(guān)鍵的作用，相對(duì)其他的光合蛋白，LHCⅡ不僅捕光效率高，還更加穩(wěn)定[9]?？茖W(xué)家已經(jīng)嘗試將LHCⅡ固定在光電陽極上，以期深入了解該色素-蛋白復(fù)合物光電流產(chǎn)生的機(jī)理，人們希望能夠通過模擬該系統(tǒng)將光能轉(zhuǎn)變成可供人類使用的電流[10]。然而，天然提取LHCⅡ過程中，不僅操作步驟繁多，收率較低，而且需要用表面活性劑將LHCⅡ從類囊體膜上溶解下來，往往會(huì)造成LHCⅡ的結(jié)構(gòu)破壞。因此，以上因素極大地限制了LHCⅡ的大規(guī)模制備及其應(yīng)用。

本文利用基因工程技術(shù)將萊茵衣藻lhcII基因在大腸桿菌中進(jìn)行過量表達(dá)，經(jīng)純化獲得重組LHCⅡ蛋白，并在體外與葉綠素a進(jìn)行重建，將得到的色素-蛋白復(fù)合物吸附在TiO2電極上，組裝生物基染料敏化太陽能電池，進(jìn)行光電表征，并將其與葉綠素a敏化太陽能電池進(jìn)行對(duì)比，從而為L(zhǎng)HCⅡ敏化的生物基太陽能電池提供重要的工作參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用萊茵衣藻lhcⅡ基因(NCBI Accession：P27523.1)由通用生物有限公司合成；所用EscherichiacoliDH5α、BL21(DE3)和載體pET-28a由本實(shí)驗(yàn)室保存；TaqDNA、限制性內(nèi)切酶BamH I、SacI、T4 DNA ligase、10×Loading buffer、D2000 DNA Ladder等均購(gòu)自Takara公司；普通質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司；TiO2電極片購(gòu)自大連七色光科技有限公司。

NanoDrop 2000 spectrophotometer(Thermo)；AKTA 蛋白純化系統(tǒng)(GE)；UV-1700型紫外可見分光光度計(jì)(SHIMADZU)；FluoroMax-4熒光光譜儀(Horiba Jobin Yvon)；質(zhì)譜儀 MALDI-TOF(Bruker)；太陽能測(cè)試系統(tǒng)(美國(guó)頤光科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取質(zhì)粒

將商業(yè)合成公司提供的pUC19-lhcII質(zhì)粒和本實(shí)驗(yàn)室保存的空載體pET-28a分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。質(zhì)粒的提取根據(jù)天根普通質(zhì)粒小提試劑盒說明書中的步驟進(jìn)行操作。提取后的質(zhì)粒用NanoDrop 2000 spectrophotometer測(cè)定濃度，pUC19-lhcⅡ平均濃度為166.5 ng/μL，pET-28a的平均濃度為79.2 ng/μL。

1.2.2 目的基因與載體的雙酶切及連接

將pUC19-lhcⅡ質(zhì)粒和pET-28a質(zhì)粒分別用SacⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化并回收DNA產(chǎn)物。

孫巖國(guó)舉例，在門診大廳掃描支付二維碼，輸入姓名、電話號(hào)碼和身份證號(hào)，選擇診室，頁面將迅速?gòu)棾鰭焯?hào)成功信息。就診后，醫(yī)囑的化驗(yàn)采血信息及時(shí)“導(dǎo)航”，顯示相關(guān)科室地點(diǎn)及距離。醫(yī)生開藥次日早晨，提醒服藥的信息已發(fā)送至患者手機(jī)，“想忘記吃藥都難”。整個(gè)過程，省卻了排隊(duì)掛號(hào)、交費(fèi)的煩惱，也不再受找不到診室而困擾。“最重要的是開通了住院預(yù)交金，一日清單、體驗(yàn)登記和報(bào)告書等移動(dòng)支付項(xiàng)目，醫(yī)保的二次結(jié)算也可順利實(shí)現(xiàn)。”

將膠回收得到的目的基因與載體按照5∶1比例進(jìn)行混合，經(jīng)T4 DNA連接酶16℃連接過夜，從而構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-lhcⅡ，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，并測(cè)序。

1.2.3 擴(kuò)大培養(yǎng)、目的蛋白純化及表征

測(cè)序結(jié)果正確后，將目的基因提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，在100 mL的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，將種子液按照1∶100的比例接入1 L的TB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD=0.8左右時(shí)，加入2 mmol/L的乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后18℃培養(yǎng)18～20 h后，收集菌體。

利用Ni2+親和色譜柱純化法進(jìn)行蛋白純化。后期表征，發(fā)現(xiàn)蛋白易形成包涵體，所以用含8 mol/L尿素的Buffer將包涵體溶解，上樣后移至AKTA蛋白純化系統(tǒng)，用含有2 mol/L尿素的洗脫液進(jìn)行蛋白洗脫并脫鹽，除去尿素后復(fù)性。將純化出的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳和質(zhì)譜分析。

1.2.4 LHCⅡ與葉綠素a的體外結(jié)合

將上述純化獲得的LHCⅡ重組蛋白，經(jīng)脫鹽柱交換buffer到重組緩沖液中，按照如下的重組方法進(jìn)行結(jié)合重組：首先從螺旋藻中提取葉綠素a[11]，然后取400 μg從大腸桿菌中提取的重組LHCⅡ蛋白，溶解在1000 μL的重組Buffer中(含有100 mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0，5 mmol/L的DTT，1 mmol/L的PMSF，12.5%的蔗糖和2%的LDS)。將該蛋白溶液于100℃加熱3 min，超聲10 min，隨后加入100 mmol/L二硫蘇糖醇及70 μL的色素乙醇溶液(3.5×10-5mol/L)，將混合物再超聲10 min。通過冰凍(1 h，-20℃)和解凍(30 min，室溫)3個(gè)循環(huán)周期，實(shí)現(xiàn)蛋白與色素的重建[12]。反復(fù)凍融結(jié)束后，將樣品放在冰上孵育15 min，最后將混合物放置在含有10 mmol/L HEPES的10 mL的蔗糖梯度(0.2～1 mol/L)中，35 700 r/min離心16 h[13]。將下游含有重建的色素-蛋白復(fù)合物的綠色帶(在約0.4 mol/L的蔗糖密度處)用注射器小心收集起來。將收集好的色素-蛋白復(fù)合物利用紫外分光光度計(jì)和熒光光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 結(jié)合率曲線測(cè)定

據(jù)報(bào)道，螺旋藻中主要含有葉綠素a[14]，因此可以根據(jù)朗伯比爾定率進(jìn)行葉綠素濃度的計(jì)算：A=Εbc，其中A為吸光度，Ε為吸收系數(shù)，葉綠素a在95%乙醇溶液中，在664 nm處的吸光系數(shù)為84.6[15]，b為樣品濃度(g/L)，c為光程(1 cm)。

蛋白濃度的測(cè)定采用Bradford(考馬斯亮藍(lán)法)[16]，操作方法根據(jù)Bradford試劑盒(TIANGEN)說明書操作，目的蛋白的分子質(zhì)量為27 829.48 u。

1.2.6 光電性能表征

將重建后的色素-蛋白復(fù)合物和同濃度的純?nèi)~綠素a溶液進(jìn)行光電性能表征，比較兩種生物基染料敏化劑的光能傳遞效率。經(jīng)過紫外分光光度計(jì)的測(cè)定，LHCⅡ中葉綠素a的濃度為4.5×10-5mol/L，配置同濃度的葉綠素a溶液。將活化后的染料敏化太陽能電池的TiO2電極片分別放入上述兩種溶液中，在暗處吸附24 h后，組裝太陽能電池，安裝在太陽能測(cè)試系統(tǒng)(美國(guó)頤光科技有限公司)上進(jìn)行測(cè)試[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因與載體雙酶切

pET-28a空質(zhì)粒和攜帶目的片段的pUC19-lhcⅡ質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出酶切后在約3、6和1 kb偏下處出現(xiàn)3個(gè)明顯的DNA條帶。泳道1在6 kb處出現(xiàn)明顯DNA條帶，質(zhì)粒載體pET-28a的分子量為5369 bp，由電泳圖中可以看出酶切后的質(zhì)粒分子量在5 kb到6 kb之間，與理論值相符，證明該質(zhì)粒酶切成功。泳道2中3 kb處應(yīng)為pUC19載體；lhcⅡ目的基因片段分子量為687 bp，故該泳道1 kb以下處為lhcⅡ目的基因條帶，該條帶分子量與理論值基本相符，證明酶切也得到相應(yīng)的目的基因片段。將DNA片段回收連接后，酶連接產(chǎn)物送上海生工公司測(cè)序后，比對(duì)測(cè)序結(jié)果后發(fā)現(xiàn)均正確，因此可以得知目的基因lhcⅡ與載體pET-28a已成功連接，可以將備份菌液活化提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，進(jìn)行菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)和蛋白的純化。

圖1 pET-28a和pUC19-lhcⅡ質(zhì)粒雙酶切后瓊脂糖電泳圖

M:雙酶切Marker；1:pET-28a；2:pUC19-lhcⅡ

2.2 SDS-PAGE電泳和質(zhì)譜分析

將所培養(yǎng)收集到的菌體破碎離心后，利用Ni2+親和色譜法從上清中提取目的蛋白，經(jīng)洗脫純化后，發(fā)現(xiàn)目的蛋白濃度較低，僅為0.12 mg/mL。經(jīng)SDS-PAGE(如圖2-A)分析發(fā)現(xiàn)，洗脫產(chǎn)物中僅存在少量目的蛋白，且純度不高。包涵體組分里存在明顯的LHCⅡ目的蛋白條帶，因此判定該蛋白主要表達(dá)存在于包涵體中。因此將包涵體組分用8 mol/L尿素溶解后，利用Ni2+親和色譜法，從包涵體中純化目的蛋白。

由圖2-A發(fā)現(xiàn)，經(jīng)包涵體純化后，條帶6和7只有一條位于28 ku左右的條帶，可知從包涵體中提取的蛋白較純，基本無雜蛋白。由圖2-B質(zhì)譜圖可以看出，目的蛋白分子量為27 871.968 u，與理論蛋白分子量27 829.48 u基本符合，可以確定已成功分離純化獲得目的蛋白LHCⅡ。

圖2 經(jīng)Ni2+親和色譜純化后各蛋白組分的SDS-PAGE電泳圖(A)和目的蛋白LHCⅡ質(zhì)譜圖(B)

M：Marker；1：破碎液上清；2：流穿液；3：從可溶性組分純化的目的蛋白；4：包涵體；5：包涵體組分流穿液；6-7：包涵體組分洗脫的目的蛋白

2.3 LHCⅡ與葉綠素a的體外結(jié)合

將所獲得的色素-蛋白復(fù)合物進(jìn)行蔗糖密度梯度(0.2～1.0 mol/L)離心，結(jié)果(如圖3)顯示，葉綠素a由于分子量小被分離到蔗糖梯度的上層，而色素-蛋白質(zhì)復(fù)合物由于分子量大可以被分離到下層從而與葉綠素a分開。由圖3可以看出，在蔗糖梯度最上層有被分離出的未結(jié)合的游離葉綠素a，而在蔗糖梯度約0.4 mol/L位置有綠色的條帶，初步判斷是結(jié)合上葉綠素a的LHCⅡ復(fù)合物。用注射器將中間的綠色條帶小心吸出，并用紫外和熒光進(jìn)行檢測(cè)(如圖4)。

圖3 蔗糖密度離心

A：經(jīng)脫鹽柱分離后的色素蛋白復(fù)合物；B：未經(jīng)脫鹽柱分離的色素蛋白復(fù)合物

通過紫外分光光度計(jì)分析可知，游離葉綠素a分子在418 nm和660 nm處有紫外吸收峰，280 nm處并沒有明顯的紫外吸收峰。而重建后所分離得到的色素-蛋白復(fù)合物，在280 nm處有明顯的蛋白峰，相對(duì)于從螺旋藻中提取的葉綠素a而言，體外重組的LHCⅡ復(fù)合物在415 nm處的吸收峰有3 nm的藍(lán)移，在662 nm處的吸收峰有2 nm的紅移。因此可以說明LHCⅡ和葉綠素在體外已經(jīng)有效結(jié)合。

為進(jìn)一步證明LHCⅡ與葉綠素a的成功結(jié)合，我們對(duì)復(fù)合物進(jìn)行熒光光譜的檢測(cè)。經(jīng)在418 nm處進(jìn)行激發(fā)，重組色素蛋白復(fù)合物最大發(fā)射峰在671 nm，與天然LHCⅡ相符。進(jìn)一步說明LHCⅡ與葉綠素a在體外重建成功。

圖4 葉綠素a和色素-蛋白復(fù)合物的紫外吸收光譜(A)和色素-蛋白復(fù)合物的紫外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜(B)

2.4 結(jié)合率飽和曲線的測(cè)定

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組LHCⅡ蛋白與葉綠素a的結(jié)合效率，我們對(duì)二者結(jié)合的飽和曲線進(jìn)行了測(cè)定。所用蛋白在595 nm處的吸光度為0.262，根據(jù)Bradford蛋白定量方法所得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=X+0.0045(圖5-A)，計(jì)算的蛋白質(zhì)含量為0.2575 mg/mL，即9.25 mmol/L。所加入葉綠素a含量的計(jì)算方法參照1.2.5中所述，隨著加入的葉綠素a與蛋白的比值的增高，色素-蛋白復(fù)合物中，蛋白結(jié)合的葉綠素a的變化趨勢(shì)如圖5-B所示。隨著加入的葉綠素a與LHCⅡ的比值的增加，在重建的色素-蛋白復(fù)合物中葉綠素a與LHCⅡ的結(jié)合率也不斷增加，最終，結(jié)合率在8.0左右達(dá)到平衡，因此認(rèn)為通過基因工程手段得到的LHCⅡ最多可以結(jié)合8個(gè)葉綠素a。這也與天然LHCⅡ蛋白可以結(jié)合8個(gè)葉綠素a分子相符，這表明重組LHCⅡ具有與天然LHCⅡ同樣的葉綠素結(jié)合能力。

圖5 葉綠素a和LHCⅡ結(jié)合曲線的計(jì)算

A：Bradford蛋白定量BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線；B：葉綠素a與LHCⅡ的結(jié)合曲線

2.5 光電性能表征

將上述重建獲得的色素-蛋白復(fù)合物和相同濃度的葉綠素a分子，按照1.2.6所述方法吸附到納米TiO2電極上，組裝成生物基染料敏化太陽能電池，并進(jìn)行光電性能表征。結(jié)果如表1，復(fù)合物和葉綠素a的I-V曲線如圖6。在AM1.5，光照強(qiáng)度為100 mW/cm2時(shí)，色素-蛋白復(fù)合物短路電流ISC為0.493 mA/cm2，開路電壓VOC為0.491 V，填充因子FF為0.679，效率η為0.165%；葉綠素a的短路電流ISC為0.596 mA/cm2，開路電壓VOC為0.482 V，填充因子FF為0.676，效率η為0.194%。相較下，葉綠素a表現(xiàn)出相對(duì)較好的光電性能。

表 1 染料敏化TiO2太陽能電池的性能(AM1.5,100 mW/cm2)

3 討論與結(jié)論

天然的LHCⅡ的提取工藝復(fù)雜，得率比較低，且需要使用表面活性劑將其從類囊體膜上溶解下來，容易造成LHCⅡ分子結(jié)構(gòu)的破壞及葉綠素脫落[18]。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建pET-28a-lhcⅡ質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21中培養(yǎng)表達(dá)后，經(jīng)過Ni2+親和層析獲得重組LHCⅡ目的蛋白，此方法簡(jiǎn)單易行，成本較低，且易獲得大量的LHCⅡ蛋白。經(jīng)過驗(yàn)證，將從包涵體中純化的蛋白經(jīng)柱上復(fù)性之后，可以在體外成功與葉綠素a進(jìn)行結(jié)合，且重組后LHCⅡ復(fù)合物的紫外吸收和熒光發(fā)射光譜都與天然LHCⅡ類似，這表明復(fù)性后的重組LHCⅡ具有結(jié)合葉綠素的活性。在此基礎(chǔ)上，通過不斷地增加重建過程中葉綠素a的量，最終使LHCⅡ與葉綠素a的結(jié)合率達(dá)到飽和，測(cè)定了色素-蛋白結(jié)合的飽和滴定曲線。經(jīng)過計(jì)算可得，每個(gè)重組LHCⅡ蛋白最多可以結(jié)合8個(gè)葉綠素a分子，與天然LHCⅡ的色素結(jié)合活性一致，這進(jìn)一步證明復(fù)性后所獲得的LHCⅡ保持了與天然LHCⅡ類似的生物活性。有文獻(xiàn)報(bào)道，LHCⅡ的化學(xué)變性過程是可逆的[19]，這或許可以解釋經(jīng)包涵體復(fù)性后的LHCⅡ可以較好地保持其生物活性的原因。

圖6 LHCⅡ復(fù)合物敏化TiO2太陽能電池的I-V曲線(A)和葉綠素a敏化TiO2太陽能電池的I-V曲線(B)

將結(jié)合8個(gè)葉綠素a的LHCⅡ和相同濃度的葉綠素a溶液分別吸附到染料敏化太陽能電池的TiO2電極上，組裝生物基染料敏化太陽能電池，經(jīng)光電性能測(cè)試發(fā)現(xiàn)，重建的LHCⅡ色素-蛋白復(fù)合物和純?nèi)~綠素a都可進(jìn)行完整的電子傳遞，兩種材料的光電轉(zhuǎn)換效率差別不大，葉綠素a的光電轉(zhuǎn)換效率稍高于LHCⅡ。分析其原因可能是由于葉綠素a分子質(zhì)量小，同樣條件下，葉綠素a在光電陽極上的吸附效果好，所以表現(xiàn)出較好的光電性能。在此基礎(chǔ)之上，我們希望通過不斷地摸索，可以得到獲得效果更佳的染料敏化太陽能電池的敏化劑。本研究為大規(guī)模制備LHCⅡ并將其應(yīng)用于生物基染料敏化太陽能電池奠定了重要的工作基礎(chǔ)。