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        耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥機(jī)制

        2018-08-15 05:46:08閆玲顧兵張麗馬萍
        實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志 2018年15期
        關(guān)鍵詞:烯酶鮑曼青霉

        閆玲 顧兵, 張麗 馬萍,

        1徐州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院(江蘇徐州 221004);2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科(江蘇徐州 221002)

        鮑曼不動(dòng)桿菌以其耐藥性廣泛、可以快速獲得抗生素耐藥基因而聞名[1?2]。對(duì)其全基因組分析表明耐藥基因大量表達(dá)[3?5],由染色體編碼的AmpC酶、頭孢菌素酶等β?內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生使該菌對(duì)很多β?內(nèi)酰胺類(lèi)藥物存在天然耐藥,但對(duì)頭孢吡肟及碳青霉烯類(lèi)藥物較穩(wěn)定。然而,由于其生長(zhǎng)特性及耐藥特性,隨著時(shí)間推移鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥性逐年上升[6],嚴(yán)重威脅公共健康,迫切要求臨床實(shí)驗(yàn)室能準(zhǔn)確識(shí)別感染與耐藥趨勢(shì)以提示臨床用藥及實(shí)施感染控制措施。本研究針對(duì)臨床分離的42株CRAB,采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)該類(lèi)細(xì)菌可能的耐藥機(jī)制進(jìn)行初步檢測(cè)和分析,為臨床用藥與感染控制的實(shí)施提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 菌株來(lái)源收集2017年1-4月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院患者臨床送檢標(biāo)本,經(jīng)Vitek?2XL全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀鑒定為至少對(duì)一種碳青霉烯類(lèi)藥物(亞胺培南)耐藥的42株非重復(fù)鮑曼不動(dòng)桿菌,其中30株來(lái)源于痰標(biāo)本、5株來(lái)源于血液標(biāo)本、6株來(lái)源于纖支鏡洗液標(biāo)本、1株來(lái)源于腦脊液標(biāo)本。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC?BAA?1705、肺炎克雷伯菌ATCC?BAA?1706購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

        1.2 主要試劑與儀器Vitek?2XL全自動(dòng)細(xì)菌鑒定與藥敏分析儀(法國(guó)梅里埃公司),ABI2720PCR擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司),DYY?8C型電泳儀(北京六一儀器廠),Bioshine Gelx1850凝膠成像系統(tǒng)(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)。GelRed(美國(guó)Biotium公司),dl2000 DNA marker(日本TaKaRa公司),2×Taq PCR MasterMix(北京天根生化科技),亞胺培南粉末、苯酚紅(美國(guó)Sigma公司),細(xì)菌蛋白質(zhì)提取液(美國(guó)Thermo公司),ZnSO4·7H2O粉末,NaOH粉末,5×TAE(上海捷瑞生物工程),Agarose LE瓊脂糖(美國(guó)Promega公司),亞胺培南(IMP)、美羅培南(MEM)藥敏紙片(10 μg)(英國(guó)OXIOD公司),哥倫比亞血平板、M?H平板(法國(guó)梅里埃公司),胰蛋白胨大豆肉湯(上??片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 抗菌藥物敏感性試驗(yàn)采用Vitek?2XL全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀對(duì)臨床標(biāo)本中分離鑒定為鮑曼不動(dòng)桿菌的菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn),高級(jí)專(zhuān)家系統(tǒng)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行核對(duì)修正后給出藥敏結(jié)果(參照CLSI2017版標(biāo)準(zhǔn)判讀)。

        1.3.2 Carba NP試驗(yàn)[7]檢測(cè)碳青霉烯酶在2 h內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果(a管為紅色或桔紅色,b管為黃色)的報(bào)告為產(chǎn)碳青霉烯酶。見(jiàn)圖1。

        圖2 mCIM試驗(yàn)Fig.2 mCIM Test

        圖1 Carba NP試驗(yàn)Fig.1 Carba NP Test

        1.3.3 mCIM[8]檢測(cè)碳青霉烯酶刮取1 μL血平板上過(guò)夜培養(yǎng)的菌落于胰蛋白胨大豆肉湯(Tryp?tone Soybean Broth,TSB)中,漩渦振搖10~ 15 s;使用無(wú)菌鑷子每管加入一張10 μg的美羅培南/亞胺培南紙片,確保整張紙片浸沒(méi)在TSB中;在(35±2)℃中培養(yǎng)4 h±15 min;在取出TSB中的美羅培南/亞胺培南紙片前,采用標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922配制0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?;按CLSI M02文件中常規(guī)紙片擴(kuò)散法的步驟于15 min內(nèi)在M?H平板上涂布上述菌懸液,干燥3~10 min;使用10 μL接種環(huán)取出TSB中的藥敏紙片,在管壁內(nèi)緣擠去多余液體放在涂布有ATCC25922的M?H平板上;在(35±2)℃中培養(yǎng)18~24 h之后,測(cè)量抑菌圈直徑大小。抑菌圈直徑為6~15 mm或在16~18 mm內(nèi)有菌落生長(zhǎng),為碳青霉烯酶陽(yáng)性;抑菌圈直徑≥19 mm為碳青霉烯酶陰性;見(jiàn)圖2。抑菌圈直徑在16~18 mm,不確定是否存在碳青霉烯酶。

        1.3.4 細(xì)菌DNA模板的制備及相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)采用煮沸法提取細(xì)菌DNA。PCR技術(shù)檢測(cè)常見(jiàn)碳青霉烯酶基因(blaKPC?2、blaNDM?1、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA?23),外排泵基因(adeB、adeJ)、整合子基因(Int1、Int2),相應(yīng)引物參照文獻(xiàn)由上海生工公司合成,引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)總體積為25 μL,包括 DNA模板2 μL,10 μmol/L上下游引物各 1 μL,2×PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 8.5 μL。產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂凝膠電泳后,用凝膠成像系統(tǒng)分析。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Kappa檢驗(yàn)比較兩種表型篩選試驗(yàn)與PCR檢測(cè)的一致性,Kappa≤0.4說(shuō)明一致性較差;Kappa≥0.75說(shuō)明一致性好。

        表1 擴(kuò)增基因引物序列、反應(yīng)條件及擴(kuò)增長(zhǎng)度Tab.1 Primer sequence,reaction conditions and amplification length of amplified genes

        2 結(jié)果

        2.1 藥敏結(jié)果42株CRAB中多重耐藥菌株占79.1%,主要表現(xiàn)為對(duì)對(duì)亞胺培南、哌拉西林、頭孢他啶、頭孢噻肟及頭孢曲松耐藥。然而這些多重耐藥的CRAB全部對(duì)替加環(huán)素敏感。

        2.2 碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果42株CRAB菌株中36株檢測(cè)到碳青霉烯酶基因,blaNDM?1型有14株、blaOXA?23型有33株,其中11株同時(shí)合并兩種基因。

        2.3 兩種方法篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的比較以PCR為金標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn),Carba NP試驗(yàn)篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的靈敏度為0,特異度為83.3%,Kappa值為0.11。mCIM試驗(yàn)采用亞胺培南紙片時(shí),其篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的靈敏度為97.2%,特異度為33.3%,Kappa值為0.88。mCIM試驗(yàn)采用美羅培南紙片時(shí),其靈敏度為13.8%、特異度為66.6%,Kappa值為0.21。mCIM試驗(yàn)采用亞胺培南紙片篩選產(chǎn)碳青霉烯酶菌株與PCR方法一致性好。

        2.4 外排泵基因42株CRAB菌株中有39株檢測(cè)到外排泵基因(92.8%)。36株經(jīng)PCR檢測(cè)碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中檢測(cè)到外排泵基因34株(94.4%),6株未檢測(cè)到碳青霉烯酶基因菌株中5株檢測(cè)到外排泵基因(83.3%),adeJ基因陽(yáng)性36株,adeB基因陽(yáng)性35株,多數(shù)菌株兩種外排泵基因同時(shí)存在。

        2.5 整合子基因檢測(cè)結(jié)果42株CRAB菌株中有25株檢測(cè)到Int1基因(59.5%),未檢測(cè)到Int2基因。36株P(guān)CR檢測(cè)為碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中22株檢測(cè)到Int1基因(61.1%),6株未檢測(cè)到碳青霉烯酶基因菌株中3株檢測(cè)到Int1基因(50%)。CRAB相關(guān)耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

        3 討論

        耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌(CRAB)菌株耐藥機(jī)制有多種:產(chǎn)生碳青霉烯酶、外膜蛋白缺失或表達(dá)降低、主動(dòng)外排系統(tǒng)過(guò)度表達(dá)、青霉素結(jié)合蛋白位點(diǎn)改變及整合子機(jī)制等[17]。耐藥機(jī)制中以產(chǎn)碳青霉烯酶為主,主要為A、B和D類(lèi)碳青霉烯酶,青霉素結(jié)合位點(diǎn)改變少見(jiàn)[18]。A類(lèi)中blaGES型分布在中東地區(qū)[19],而blaKPC型罕見(jiàn)[20];B 類(lèi)中blaIMP、blaVIM、blaNDM型在鮑曼不動(dòng)桿菌中都有檢出[21-22];D 類(lèi)中blaOXA?23、blaOXA?40、blaOXA?51、blaOXA?58、blaOXA?143這 5種亞組是鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物獲得性耐藥的首要原因。本試驗(yàn)36株碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中,檢測(cè)到blaNDM?1型與blaOXA?23型兩種碳青霉烯酶編碼基因,碳青霉烯酶流行情況同上述研究結(jié)果相同。編碼碳青霉烯酶的基因主要位于可移動(dòng)基因如質(zhì)?;蜣D(zhuǎn)座子上,使得耐藥性在鮑曼不動(dòng)桿菌屬間傳播,而且產(chǎn)碳青霉烯酶菌株毒力更強(qiáng)[23],因此實(shí)驗(yàn)室能夠有效檢測(cè)菌株的耐藥機(jī)制對(duì)臨床治療意義重大。

        表2 CRAB菌株相關(guān)耐藥基因及碳青霉烯酶表型檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection of resistance genes and carbapenem phenotype in CRAB strain

        為了提高實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株的能力,CLSI不斷推出產(chǎn)碳青霉烯酶菌株表型篩選方法,改良Hodge試驗(yàn)被用于體外檢測(cè)碳青霉烯酶活性,但難以檢測(cè)到產(chǎn)blaNDM型與blaOXA型的菌株,同時(shí)非產(chǎn)酶菌株該試驗(yàn)可能為陽(yáng)性。Carba NP試驗(yàn)基于pH值與比色法檢測(cè)亞胺培南β-內(nèi)酰胺環(huán)是否水解,該試驗(yàn)對(duì)所配試劑的pH值要求嚴(yán)格,且難以檢測(cè)到粘液型菌株與產(chǎn)blaOXA?48型菌株。mCIM是采用美羅培南藥敏紙片檢測(cè)菌株中是否存在碳青霉烯酶,該方法操作簡(jiǎn)便價(jià)格低廉,目前推薦用于產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的篩選。本試驗(yàn)36株碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中,35株mCIM陽(yáng)性,Carba NP試驗(yàn)全部陰性。6株未檢測(cè)到碳青霉烯酶編碼基因的菌株中,4株mCIM陽(yáng)性,1株Carba NP陽(yáng)性。mCIM試驗(yàn)采用亞胺培南紙片時(shí),與PCR方法的一致性最好(Kappa=0.88)。相比Carba NP,mCIM更適用于產(chǎn)碳青霉烯酶鮑曼不動(dòng)桿菌的表型篩選。對(duì)于出現(xiàn)表型篩選陽(yáng)性而基因檢測(cè)陰性的菌株是因?yàn)樵囼?yàn)設(shè)計(jì)引物有限未涉及到所有碳青霉烯酶基因,進(jìn)一步說(shuō)明PCR方法只適用于已知碳青霉烯酶菌株檢測(cè)的局限性。

        整合子是保守的類(lèi)似于轉(zhuǎn)座子的DNA元素,具有捕捉與調(diào)動(dòng)基因盒的能力。整合子基因陽(yáng)性菌株與多藥耐藥顯著相關(guān)[24],其可作為耐藥基因的載體進(jìn)行耐藥機(jī)制的傳播。Int1是臨床分離鮑曼不動(dòng)桿菌中最常檢測(cè)到的整合子基因型[25]。本試驗(yàn)42株CRAB菌株中有25株檢測(cè)到Int1基因,未檢測(cè)到Int2基因,CRAB菌株整合子的攜帶率達(dá)到59.5%,說(shuō)明鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥與 Int1 有關(guān)。blaNDM?1型與blaOXA?23型碳青霉烯酶編碼基因的36株菌中,22株檢測(cè)到Int1基因,產(chǎn)酶菌株整合子的攜帶率為61.1%,整合子的存在使獲得性來(lái)源的碳青霉烯酶的編碼序列能在不同菌屬間橫向傳播。

        耐藥節(jié)結(jié)化細(xì)胞分化(RND)超家族中的Ade?ABC、AdeIJK、AdeFGH與鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥相關(guān)。如果編碼這些外排泵蛋白的基因或相關(guān)基因發(fā)生突變可致其高表達(dá),并且抗菌藥使用的壓力使主動(dòng)外排泵活性增強(qiáng)。研究[26]表明AdeABC外排泵的過(guò)度表達(dá)使亞胺培南和美羅培南的MIC值增加了2倍,說(shuō)明AdeABC外排泵在鮑曼不動(dòng)桿菌耐碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥機(jī)制中起作用,而且與D類(lèi)碳青霉烯酶作用時(shí),會(huì)出現(xiàn)協(xié)同耐藥效應(yīng)。FERNANDO[27]研究表明過(guò)度表達(dá)的adeB在耐藥中起重要作用。SUGAWARA等[28]研究表明 AdeI?JK表達(dá)的同時(shí)伴有AdeABC的表達(dá),二者在多重耐藥中具有協(xié)同作用。本試驗(yàn)42株CRAB菌株中有35株檢測(cè)到AdeB基因,36株檢測(cè)到AdeJ基因,其中32株同時(shí)合并AdeB、AdeJ兩種基因的情況下,伴有blaOXA?23型碳青霉烯酶的存在,提示外排泵基因的過(guò)度表達(dá)與碳青霉烯酶協(xié)同作用導(dǎo)致對(duì)碳青霉烯類(lèi)藥物的耐藥。

        本研究中收集的CRAB菌株全部對(duì)替加環(huán)素敏感,替加環(huán)素作為第一種被FDA批準(zhǔn)上市的甘氨酰四環(huán)素抗菌藥,該藥具有臨床用藥方便、與其他藥物無(wú)交叉耐藥且肝腎毒性低等特點(diǎn)[29]。張冀霞等[30]對(duì)11個(gè)城市15家三級(jí)甲等教學(xué)醫(yī)院臨床常見(jiàn)多重耐藥菌進(jìn)行研究,結(jié)果表明,替加環(huán)素對(duì)臨床常見(jiàn)多重耐藥菌(包括MRSA、VRE、產(chǎn)ESBL及耐碳青霉烯類(lèi)腸桿菌科細(xì)菌和鮑曼不動(dòng)桿菌)均具有良好的體外抗菌活性。其結(jié)論與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致,替加環(huán)素對(duì)CRAB感染治療具有樂(lè)觀的前景,但是仍需要做好其藥敏監(jiān)測(cè)工作,及時(shí)指導(dǎo)臨床合理用藥。

        本研究臨床分離耐碳青霉烯類(lèi)鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜,多數(shù)菌株產(chǎn)碳青霉烯酶的同時(shí)伴有外排泵基因、整合子基因的大量表達(dá)。提示臨床醫(yī)生用藥時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵循用藥原則,盡量減少抗生素的選擇性壓力;需要實(shí)驗(yàn)室選擇有效的產(chǎn)碳青酶烯酶表型篩選方法(mCIM)檢測(cè)可疑產(chǎn)酶菌株,為CRAB菌株的預(yù)防控制提供準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

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