凌奕文 張復華 趙瑩 陳焯文

1佛山市第一人民醫(yī)院血液淋巴瘤科（廣東佛山 528000）；2佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院血液科（廣東佛山 528200）

髓源性抑制細胞（MDSCs）是一群異質性細胞，來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，表面標志為CD33+CD11b+HLA?DR-。MDSCs可通過多種途徑發(fā)揮免疫抑制功能，包括：（1）誘導一氧化氮合酶（iNOS）活性的改變，使NO的合成和分泌受到影響，從而誘導T細胞發(fā)生凋亡；（2）干擾L?精氨酸代謝通路，MDSCs細胞內高表達精氨酸酶1（Arg?1），通過消耗大量L?精氨酸使T細胞攝取精氨酸減少，最終導致T細胞功能與增殖減弱；（3）誘導調節(jié)性T細胞（Treg）增殖，從而干擾到T細胞的活化［1-2］；（4）可釋放ROS，誘導T細胞凋亡和使T細胞受體硝基化，最終影響T細胞活化；（5）下調選擇素L（CD62L）的表達，使未活化T細胞歸巢減少，不能遷移到淋巴結中被腫瘤抗原所激活，最終影響T細胞的免疫應答。原發(fā)性免疫性血小板減少性紫癜（ITP）是一種以血小板過度破壞和/或血小板生成減少為特點的自身免疫性出血性疾病。ITP的病理生理過程至今未得到闡明，T細胞異常被認為在ITP發(fā)病機制中占重要作用，一些免疫調節(jié)細胞得到關注，如Th細胞失衡［3-4］，Treg細胞數量減少及缺陷5，細胞毒性T細胞破壞血小板［6-7］。由于ITP發(fā)病機制的復雜及難治性ITP的治療困境，臨床亟需闡明ITP發(fā)病機制及尋找ITP治療新靶點。在自身免疫性疾病動物模型中，MDSCs對頭發(fā)、胰腺起保護作用，抑制其病理損傷［8-9］；同時，MDSCs對神經系統(tǒng)起病理損傷作用［10］，這使得MDSCs可能成為治療自身免疫性疾病的新靶點。但是，在ITP這個自身免疫性出血性疾病中，MD?SCs起的作用未得到闡明。本文通過研究MDSCs及淋巴細胞亞群在ITP患者發(fā)病及治療過程中的動態(tài)變化，進一步探討ITP的發(fā)病機制，為ITP的診療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2016年1月至2017年8月接受治療的ITP患者55例，其中男19例，女36例，中位年齡34歲（17～55歲）；健康體檢者60例，其中男21例，女39例，中位年齡33歲（21～57歲）。所有ITP患者均符合文獻［11］中的診斷標準，排除常見導致繼發(fā)性血小板減少病因，如自身免疫性疾病、腫瘤、藥物因素等。排除標準：（1）心、肝、腎等重要器官功能異常者；（2）合并重癥感染；（3）妊娠；（4）血栓病史；（5）失訪患者。ITP初始治療給予標準劑量的糖皮質激素［潑尼松1 mg/（kg·d），或等效地塞米松、甲潑尼松］或沖擊治療（甲潑尼松0.5～1.0 g/d，3 d），根據臨床出血情況及PLT水平，決定是否給予丙種球蛋白沖擊及血小板輸注，單用糖皮質激素治療無效，則加用重組人血小板生成素、艾曲波帕、切脾或環(huán)孢素等二線治療。

1.2 研究方法55例ITP患者作為研究組，60例健康體檢者作為對照組。分別檢測對照組、研究組外周血中MDSCs水平、T細胞亞群、iNOS及ARG表達。采用流式細胞術（FACS）檢測外周血中MD?SCs、T 細胞亞群，檢測管加入：（1）CD11b?FITC、CD33?PE、HLA?DR?APC單抗各 7 μL；（2）CD8?PE、CD4?APC、CD3?PECY5；（3）CD4?FITC、CD25?PECY5。對照管加入鼠抗人IgG?FITC、IgG?PE、IgG?APC、IgG?PECY5單抗各7 μL。各管再加入120 μL全血，避光孵育20 min。（2）加入紅細胞裂解液3～4 mL，避光孵育8～10 min。（3）PBS洗滌2次（1 000 r/min，5 min），最后500 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測。每份標本測定5 000個細胞，全部數據用流式細胞儀自帶軟件獲取和分析，測定MDSCs、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分率。

ELISA法檢測iNOS、ARG表達。步驟：（1）加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔不加任何液體，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30 min。（2）溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μL/每孔，甩干，最后用力在洗水紙上拍干。（3）每孔加酶結合物100 μL，空白孔不加?；靹颍?7 ℃，30 min。（4）溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1 ～ 2 min，200 μL/每孔，甩干，最后用力在洗水紙上拍干。（5）依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色。（30 min內，此時肉眼可見標準品的前3～4孔有明顯的梯度蘭色，后3～4孔梯度不明顯，即可終止）。（6）依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。（7）在加終止液后立即進行檢測，用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的OD值。

1.3 療效標準參照ITP國際工作組2007年制定的療效標準［12］，完全反應（CR）：治療后PLT ≥ 100×109/L且無出血；有效（R）：治療后PLT≥30×109/L且至少比基礎PLT增加2倍，且沒有出血；無效（NR）：治療后PLT＜30×109/L或者PLT增加不到基礎值的2倍或者有出血。

1.4 統(tǒng)計學方法結果以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗、非參數相關分析方法，應用統(tǒng)計軟件SPSS 15.0分析。

2 結果

2.1 MDSCs水平研究組外周血中MDSCs比例低于對照組［（1.75± 0.34）%vs.（0.78±0.45）%］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；研究組中治療達CR及R者，治療后外周血中MDSCs比例高于發(fā)病時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）；研究組中治療NR者，治療后外周血中MDSCs比例稍高于發(fā)病時，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 研究組治療前后外周血MDSCs比例Tab.2 The proportion of MDSCs in peripheral blood beforeand after treatment in the study group ± s，%

表1 研究組治療前后外周血MDSCs比例Tab.2 The proportion of MDSCs in peripheral blood beforeand after treatment in the study group ± s，%

發(fā)病時MDSCs治療后MDSCs P值CR+R 0.76±0.39 1.65±0.36 0.003 NR 0.79±0.46 0.80±0.35 0.895

2.2 淋巴細胞亞群水平研究組外周血中CD3+CD4+細胞與CD3+CD8+細胞均高于對照組，CD4+CD25+細胞則低于對照組，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表2）。研究組中治療達CR及R者，治療后外周血中CD4+CD25+細胞比例高于發(fā)病時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）；研究組中治療NR者，治療后外周血中CD3+CD4+細胞、CD4+CD25+細胞比例低于發(fā)病時，CD3+CD8+細胞高于發(fā)病時，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表3）。

表2 對照組與研究組患者外周血淋巴細胞亞群比例Tab.2 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood in the control group and the study group ± s，%

表2 對照組與研究組患者外周血淋巴細胞亞群比例Tab.2 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood in the control group and the study group ± s，%

組別對照組研究組P值CD3+CD4+細胞36.15±7.31 38.15±7.65 0.865 CD3+CD8+細胞28.50±7.30 32.40±6.85 0.854 CD4+CD25+細胞0.86±0.44 0.35±0.64 0.08

表3 研究組治療前后淋巴細胞亞群比例Tab.3 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，%

表3 研究組治療前后淋巴細胞亞群比例Tab.3 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，%

CR+R NR CD3+CD4+細胞CD3+CD8+細胞CD4+CD25+細胞發(fā)病時37.35±7.55 30.40±6.74 0.25±0.54治療后39.35±8.35 35.35±7.15 0.95±0.63 P值0.915 0.887 0.042發(fā)病時38.65±7.75 33.40±6.96 0.38±0.69治療后37.80±7.35 36.45±6.57 0.36±0.54 P值0.924 0.858 0.835

2.3 iNOS、ARG表達研究組外周血中iNOS、ARG表達水平均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表4）；研究組中治療達CR及R者，治療后外周血中iNOS、ARG表達水平比例高于發(fā)病時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表5）；研究組中治療NR者，治療后外周血中iNOS、ARG表達水平稍高于發(fā)病時，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表5）。

表4 對照組與研究組患者外周血iNOS、ARG表達水平Tab.4 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood in the control group and the study group ± s，mIU/mL

表4 對照組與研究組患者外周血iNOS、ARG表達水平Tab.4 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood in the control group and the study group ± s，mIU/mL

組別對照組研究組P值iNOS 1.02±0.13 0.54±0.33 0.023 ARG 0.86±0.15 0.32±0.19 0.034

表5 研究組治療前后外周血iNOS、ARG表達水平Tab.5 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，mIU/mL

表5 研究組治療前后外周血iNOS、ARG表達水平Tab.5 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，mIU/mL

CR+R NR iNOS發(fā)病時ARG發(fā)病時0.62±0.41 0.34±0.11治療后1.53±0.31 0.95±0.23 P值0.012 0.037發(fā)病時0.43±0.53 0.30±0.10治療后0.54±0.36 0.34±0.12 P值0.828 0.894

3 討論

ITP是一種自身免疫性疾病，現認為該病的發(fā)生主要是由免疫因素介導的巨核細胞成熟障礙與細胞毒性T細胞、自身抗體介導的PLT破壞所致［13］。但確切發(fā)病機制至今未得到闡明。ITP患者療效相差甚遠，有單用糖皮質激素可治愈的，有需要使用二線免疫抑制藥物的，亦有多藥耐藥的難治性ITP。難治性ITP的治療使得患者生存質量明顯下降，甚至不亞于惡性腫瘤。因此，尋找治療ITP的新靶點，一直是臨床熱門研究。

既往，MDSCs研究主要集中在實體腫瘤領域，其促進腫瘤免疫逃逸及其可能相關機制：（1）抑制T細胞的增殖能力［14-15］。（2）分化為2型巨噬細胞發(fā)揮免疫抑制作用［16］。（3）誘導Treg細胞的產生［17］。近年來，在血液系統(tǒng)疾病方面研究逐漸增多。體外實驗表明，多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中的MDSCs可抑制T細胞活性，而正常人的MDSCs則未表現出相關免疫抑制活性［18］。GORGUN等［19］發(fā)現MDSCs對CD8+T細胞有較強的免疫抑制活性。在淋巴瘤小鼠模型中分離的MDSCs可影響CD8+T細胞增殖［20］。而在自身免疫性疾病方面，主要研究集中在動物模型上，部分研究表明MDSCs起保護性作用，部分研究表明其介導損傷作用。至于MDSCs在ITP患者發(fā)病的病理生理過程中起的什么作用，至今少有文獻闡述。

文獻報道［21］，ITP患者體內MDSCs的數量及功能均被負向調控，大劑量地塞米松可以改變ITP患者體內MDSCs的功能。本研究通過檢測ITP患者發(fā)病及治療過程中的外周血MDSCs發(fā)現，ITP患者外周血中的MDSCs較健康者明顯下降，與文獻報道一致［21］。而治療顯效（CR+R）的患者體內MD?SCs、Treg細胞明顯上升，提示MDSCs、Treg細胞可能參與改變ITP患者免疫失衡狀態(tài)。進一步研究發(fā)現，治療顯效的患者體內iNOS、ARG表達水平高于發(fā)病時，提示MDSCs可能通過誘導iNOS活性的改變和干擾L-精氨酸代謝通路來實現其改變ITP患者免疫失衡狀態(tài)。

綜上，本研究表明，ITP患者外周血中的MDSCs較健康者明顯下降。MDSCs、Treg細胞可能參與改變ITP患者免疫失衡狀態(tài)，需要進一步實驗證實。