李城 李昌熙 王大新 戴燕 金世光

江蘇省蘇北人民醫(yī)院1疼痛科，2醫(yī)學(xué)實驗研究中心（江蘇揚州 225001）

近30年來，原發(fā)性惡性腦腫瘤發(fā)生率逐年遞增，年增長率約為1.2%［1-2］。LncRNA H19基因位于人類染色體11P 15.5，全長2.3 kb。長非編碼RNA能夠與RNA結(jié)合蛋白相互結(jié)合進(jìn)而參與蛋白質(zhì)之間的相互作用；還能夠以“海綿”體形式吸附microRNA影響其對下游靶基因的調(diào)節(jié)作用［3-5］。本課題組通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)H19可能直接結(jié)合miR?29b，同時預(yù)測發(fā)現(xiàn)，賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）為miR?29b的潛在靶基因。通過膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中干擾和過表達(dá)H19能夠發(fā)現(xiàn)負(fù)調(diào)控miR?29b的表達(dá)。miR?29b能夠調(diào)控DNMT3B?MTSS1軸來抑制肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）發(fā)生［6］。LOX通過氧化膠原和彈性蛋白的賴氨酸殘基來起始這些纖維性蛋白的共價交聯(lián)，從而穩(wěn)定細(xì)胞外基質(zhì)［7-8］。有研究表明LOX能夠使細(xì)胞外膠原交聯(lián)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移［9］。因此，本研究深入探討LncRNA H19、miR?29b、LOX信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的功能作用。

1 材料與方法

1.1 試劑0.25%胰蛋白酶消化液，RNA酶，10%胎牛血清H?DMEM培養(yǎng)液，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1、SW1088（實驗室保存）。

1.2 儀器qRT?PCR儀（ABI StepOne Plus），生物安全柜 1205A（FORMA），CO2培養(yǎng)箱（FORMA），倒置顯微鏡IX70（OLYMPUS），超純水機(jī)（Milli?Q Advan?tage A10），正置熒光顯微鏡（Zeiss Axio Scope A1）。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測樣本中H19、LOX表達(dá)水平收集100例（50例正常及50例膠質(zhì)瘤患者）樣本，將上述臨床樣本提取RNA和蛋白，利用熒光定量PCR檢測H19、LOX表達(dá)水平。

1.3.2 Transwell法檢測干擾和過表達(dá)H19膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成能力將轉(zhuǎn)染H19過表達(dá)或敲除的U87?2M1、SW1088膠質(zhì)瘤細(xì)胞胰酶消化、離心，棄上清液，重懸于無血清培養(yǎng)基中，再將細(xì)胞置于含有Matrigel侵襲室內(nèi)，在下室中加入有血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)。次日用4%低聚甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，棄小室內(nèi)液體，用棉簽輕輕擦干，并置于顯微鏡下拍照。

1.3.3 細(xì)胞劃痕實驗檢測干擾和過表達(dá)H19膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力將H19過表達(dá)或敲除的U87?2M1膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日觀察細(xì)胞，待鋪滿培養(yǎng)板后，用200 μL槍頭垂直畫線，形成間隙。PBS重復(fù)洗3遍，再加入不含血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、24 h顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 利用生物信息學(xué)軟件Starbase，TargetScan預(yù)測miR?29b的靶基因通過生物信息學(xué)系統(tǒng)分析了潛在的RNA?RNA和RNA?蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，其中包括miRNA和LncRNA相互作用。

1.3.5 利用熒光素酶實驗檢測H19與miR?29b之間的調(diào)控關(guān)系構(gòu)建H19野生型及突變型熒光素酶報告基因載體，過表達(dá)和敲除miR?29b檢測熒光素酶表達(dá)水平。（1）將細(xì)胞裂解液充分混勻，加入細(xì)胞裂解液，冰上孵育5 min，充分裂解細(xì)胞。10 000 ～ 16 000 r/min離心1 min，取上清。（2）取20 μL細(xì)胞裂解液，加至黑色酶標(biāo)板中。加入100 μL螢火蟲熒光素酶反應(yīng)液，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力，檢測盡量在30 min內(nèi)完成。

1.3.6 Trans well法檢測干擾和過表達(dá)LOX膠質(zhì)瘤細(xì)胞的克隆形成能力將轉(zhuǎn)染LOX過表達(dá)或敲除的U87?2M1、SW1088膠質(zhì)瘤細(xì)胞胰酶消化、離心，棄上清液，重懸于無血清培養(yǎng)基中，再將細(xì)胞置于含有Matrigel侵襲室內(nèi)，在下室中加入有血清的培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)。次日用4%低聚甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色15 min，棄小室內(nèi)液體，用棉簽輕輕擦干，并置于顯微鏡下拍照。

1.3.7 細(xì)胞劃痕實驗檢測干擾和過表達(dá)LOX膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力將LOX過表達(dá)或敲除的U87?2M1膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日觀察細(xì)胞，待鋪滿培養(yǎng)板后，用200 μL槍頭垂直畫線，形成間隙。PBS重復(fù)洗3遍，再加入不含血清的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于0、24 h顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計分析軟件，統(tǒng)計學(xué)處理采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1qRT?PCR檢測長非編碼RNAH19和LOX在正常及膠質(zhì)瘤100例臨床標(biāo)本中進(jìn)行qRT?PCR檢測，發(fā)現(xiàn)隨著轉(zhuǎn)移程度異常表達(dá)量越高。見圖1。

圖1 qRT?PCR檢測臨床正常及膠質(zhì)瘤樣本中H19、LOX表達(dá)差異Fig.1 qRT?PCR results assessed the H19 and LOX expressions in clinical normal cells and glioma cancer cells

2.2 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中干擾和過表達(dá)H19能夠影響細(xì)胞的克隆形成能力在U87?2M1、SW1088膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干擾H19降低細(xì)胞的克隆能力，過表達(dá)H19增加細(xì)胞的克隆能力。見圖2。

圖2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1、SW1088中干擾和過表達(dá)H19對細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig.2 The colony formation ability was examined after intervening or over?expressing H19 in U87?2M1 and SW1088 glioma cancer cell lines

2.3 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中干擾和過表達(dá)H19能夠影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力在U87?2M1膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干擾H19降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，過表達(dá)H19增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。見圖3。

圖3 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1中干擾和過表達(dá)H19對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響Fig.3 The investigation of invasiveness of U87?2M1 cells afterintervening or over?expressing H19

2.4 生物信息學(xué)預(yù)測miR?29b的靶基因利用生物信息學(xué)軟件Starbase、TargetScan，發(fā)現(xiàn)H19能夠結(jié)合miR?29b（圖4），而且miR?29b能夠潛在靶向LOX、COL1A1、COL5A1、COL3A1、COL4A5基因。見圖5。

圖4 LncRNA?H19 靶向miR?29b預(yù)測分析Fig4 The impact of LncRNA?H19 on miR?29b expression

圖5 miR?29b靶向基因預(yù)測Fig.5 The prediction of miR?29b targeted gene sequences

2.5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干擾和過表達(dá)H19能夠影響miR?29b的表達(dá)熒光素酶實驗檢測發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干擾H19增加miR?29b的表達(dá)，過表達(dá)H19降低miR?29b的表達(dá)。見圖6。

圖6 過表達(dá)和干擾H19后miR?29b表達(dá)情況Fig.6 The expressions of miR?29b after overexpressing or intervening H19

2.6 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中干擾和過表達(dá)LOX能夠影響細(xì)胞的克隆形成能力U87?2M1、SW1088膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干擾LOX降低細(xì)胞的克隆能力，過表達(dá)LOX增加細(xì)胞的克隆能力。見圖7。

2.7 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中干擾和過表達(dá)LOX能夠影響細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力U87?2M1膠質(zhì)瘤細(xì)胞中干擾H19降低細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，過表達(dá)H19增加細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，見圖8。

3 討論

圖8 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1中干擾和過表達(dá)LOX，檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力Fig.8 The impact of overexpression or knockdown of LOX on the transformative ability of U87?2M1 glioma cancer cells

圖7 膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87?2M1、SW1088中干擾和過表達(dá)LOX，檢測細(xì)胞的克隆形成能力Fig.7 The influence of overexpression or knockdown of LOX on the colony formation of U87?2M1 and SW1088 glioma cancer cells

據(jù)文獻(xiàn)報道，中國腦膠質(zhì)瘤年發(fā)病率為3～6人/10萬人，年死亡人數(shù)達(dá)3萬人，手術(shù)加放化療的平均生存期僅為8～11個月［10］。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的分類系統(tǒng)及惡性程度，腦膠質(zhì)瘤可分為Ⅰ～Ⅳ4個等級。Ⅰ和Ⅱ級膠質(zhì)瘤惡性程度較低，Ⅲ和Ⅳ級膠質(zhì)瘤惡性程度很高，平均生存期僅1年左右，是威脅人類生命健康最嚴(yán)重的惡性腫瘤之一［11-13］。目前對于膠質(zhì)瘤的治療方法包括手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療、生物治療等。然而，預(yù)后的改善仍然較為有限［14-15］。尋找有效的神經(jīng)膠質(zhì)瘤分子診斷標(biāo)記和分子靶點，阻斷腫瘤細(xì)胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移，提升治療效率一直是迫切需要解決的臨床課題。

本研究對臨床膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)隨著膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移程度異常高表達(dá)長非編碼RNA?H19、LOX。繼而，本研究發(fā)現(xiàn)在U87?2M1、SW1088細(xì)胞系進(jìn)行干擾和過表達(dá)H19、LOX，能夠影響細(xì)胞的克隆形成及轉(zhuǎn)移能力。表明LncRNA?H19、LOX在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)H19可能直接結(jié)合miR?29b，LOX為miR?29b的潛在靶基因。同時H19能夠負(fù)調(diào)控miR?29b的表達(dá)。本研究從臨床組織水平入手，將闡明LncRNA?H19和miR?29b在正常及膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及相互關(guān)系，擬構(gòu)建一個LncRNA?H19、miR?29b和靶基因LOX信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，擬揭示對膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，同時過表達(dá)和敲除H19的穩(wěn)定膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，可用于小鼠模型治療實驗，為膠質(zhì)瘤靶點治療提供依據(jù)?；谝陨侠碚摵颓捌趯嶒灲Y(jié)果筆者提出下面幾個假設(shè)：（1）H19促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲是通過結(jié)合miR?29b；（2）miR?29b靶向調(diào)節(jié)LOX基因使細(xì)胞外基質(zhì)改變；（3）細(xì)胞外基質(zhì)的改變介導(dǎo)EMT信號通路影響腦膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移。

為了進(jìn)一步驗證該假設(shè)的正確性，在今后研究中深入探討LncRNA H19/miR?29b/LOX信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在膠質(zhì)瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的功能作用，并闡明其詳細(xì)分子機(jī)制。本研究能進(jìn)一步豐富長非編碼RNA的功能作用和分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤生物治療提供新的理論依據(jù)和新的治療靶點。