李雪 彭亞詩 舒密 南瓊

昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（昆明 650032）

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，具有高發(fā)病率和致死率［1］。結(jié)直腸癌早期缺乏特異的臨床癥狀，以及不能獲得及時、規(guī)范的治療，多數(shù)患者就診時已處于中晚期。隨著近年來分子生物學的飛速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)一類微小RNA（miRNA）與結(jié)直腸癌關(guān)系密切［2］，且已有研究表明miRNA作為癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并可作為腫瘤的預后靶分子［3-4］。我們前期基因高通量Miseq測序發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中miRNA 452?5P及miRNA 215?5P存在差異性表達，且miRNA 452?5P及miRNA 215?5P在結(jié)直腸癌中未經(jīng)報道。因此我們希望對miRNA 452?5P及miRNA 215?5P 在結(jié)直腸癌患者中的表達及臨床診斷價值進行更多的研究。期望探索出潛在的結(jié)直腸癌診斷價值的分子標志物和治療靶點。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2017年7-10月在昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心行腸鏡檢查病理診斷為結(jié)直腸癌的患者標本30組?；颊吆炇鹬橥鈺?，并確定患者未做過放化療及免疫治療。年齡：＜60歲14例，＞60歲16例；性別：男16例，女14例；分化程度：低中分化16例，高分化14例；浸潤深度：T2 6例，T3～T4 24例；淋巴轉(zhuǎn)移：無淋巴轉(zhuǎn)移17例，淋巴轉(zhuǎn)移13例；Ducks分期：A+B期20例，C+D期10例。

1.2 主要試劑實驗中所用Trizol購自上海生工公司；miRNeasy Serum/Plasma kit、miRcute Plus miRNA First?Strand cDNA Synthesis Kit，2×Power Taq PCR miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）購自TIANGEN公司，所用引物U6、has?miR?452?5P、has?miR?215?5P均購自廣州復能公司。

1.3 研究方法根據(jù)TIANGEN公司miRNeasy Se?rum/Plasma kit試劑盒說明書提取總RNA，實時熒光定量PCR，根據(jù)TIANGEN公司提供miRcute Plus miRNA First?Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照2×Power Taq PCR miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit（SYBR Green）試劑盒說明書提供的方法在RT?PCR ABI7300儀上進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，以U6為內(nèi)參照。反應(yīng)結(jié)束后由配套的計算機軟件計算各反應(yīng)管內(nèi)的CT值。采用相對定量方法以公式2?ΔΔCt來計算每種 miRNAs的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)性分布計量資料以均數(shù)±標準差表示。偏態(tài)計量資料以中位數(shù)M（P25，P75）表示。兩組間正態(tài)分布比較采用t檢驗，偏態(tài)分布采用非參數(shù)檢驗Mann Whitney分析。對計量資料作受試者特征曲線（ROC），計算ROC曲線下面積（AUC），AUC 0.5～0.7為診斷價值較差，＞0.7～0.9為診斷價值中等，＞0.9為診斷價值高。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高通量Miseq測序結(jié)果結(jié)直腸癌組織與正常癌旁組織差異表達miRNA中41種miRNA表達上調(diào)，62種miRNA表達下調(diào)。其中miR?452?5P在結(jié)直腸癌組織中表達顯著下調(diào)，miR?215?5P在結(jié)直腸癌組織中表達顯著上調(diào)（表1）。

2.2 miRNA 452?5P及miRNA 215?5P在結(jié)直腸癌組織中表達miRNA 452?5P在結(jié)直腸癌組織中表達量是205.19±123.27，在癌旁正常腸黏膜組織中表達量是 576.32± 182.4，miRNA 452?5P在結(jié)腸癌組織中表達顯著下調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義（t=6.078，P＜0.001）（圖1）。miRNA 215?5p在結(jié)直腸癌組織中表達量是3.46±1.27，在癌旁正常腸黏膜組織中表達量是2.07 ± 1.22，miRNA215?5p在結(jié)腸癌組織中表達顯著上調(diào)，且差異有統(tǒng)計學意義（t=-2.836，P＜0.001）。見圖2。

2.3 miRNA 452?5P及miRNA 215?5P與結(jié)直腸癌患者臨床病理資料比較miRNA 452?5p在結(jié)直腸癌中表達與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、Dukes分期、組織分型等均不相關(guān)（表2）。miRNA 215?5p在結(jié)直腸癌中表達與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、Dukes分期、組織分型等均不相關(guān)。見表3。

2.4 miRNA 452?5P、miRNA 215?5P、2?miRNAs panel對結(jié)直腸癌診斷價值繪制ROC曲線和曲線下面積AUC評估m(xù)iRNA 452?5p、miRNA 215?5p及miRNA panel的診斷價值。miRNA 452?5p曲線下面積AUC=0.859（P＜0.001，95%CI=0.719～0.999），miRNA 215?5p曲線下面積為 AUC=0.879（P＜0.001，95%CI=0.757～ 1.0）。采用二元Logistic回歸分析方法將miRNA 452?5p、miRNA 215?5p引入回歸方程，構(gòu)建2?miRNAs panel，2?miRNAs panel曲線下面積為AUC=0.930（P＜0.001，95%CI=0.833～1.0）。miRNA 452?5p、miRNA 215?5p對結(jié)直腸癌診斷價值中等；2?miRNAs panel對結(jié)直腸癌診斷價值較高（圖3、4）。

3 討論

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅人類生命健康，其發(fā)病機制尚未完全明確［5］，癌基因激活與抑癌基因失活、DNA的甲基化、信號通路改變、表觀遺傳學改變、基因多態(tài)性等均可能誘導其發(fā)生［6］。miRNAs是近幾年分子生物學和表觀遺傳學研究熱點，miRNAs可以通過調(diào)控基因的表達來參與并改變重要的生物學過程，如細胞的增殖、侵襲、凋亡、分化與血管生成等［7］。且對轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后翻譯也起著重要的調(diào)控作用。隨著技術(shù)提高人們對miRNA基因表達調(diào)控作用認識的加深，可以發(fā)現(xiàn)miRNAs的表達與許多腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［8］。如miR?940在前列腺癌中表達下調(diào)［9］、miR?135a在胃癌中表達下調(diào)［10］、miR?19a在膀胱癌中表達上調(diào)［11］、miRNA?10b在乳腺癌中表達上調(diào)［12］等?？梢钥闯?，miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中可能起到類似癌基因或抑癌基因的作用。此外，miRNA在腫瘤診斷、治療、預后評估中均具有重要價值。

表1 結(jié)直腸癌組織與正常癌旁組織中差異表達miRNATab.1 Differential expression of miRNA in colorectal cancer tissues and normal para cancerous tissues

圖1 miRNA 452?5p在結(jié)直腸癌組織與癌旁正常腸粘膜組織中表達量Fig.1 miRNA 452?5p expression in colorectal carcinoma tissue and normal intestinal mucosa adjacent to cancer

圖2 miRNA 215?5p在結(jié)直腸癌組織與癌旁正常腸粘膜組織中表達量Fig.2 miRNA 215?5p expression in colorectal carcinoma tissue and normal intestinal mucosa adjacent to cancer

表2 miRNA 452?5p表達量與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征間關(guān)系Tab.2 miRNA 452?5p expression and the relationship between the clinicopathological features of colorectal cancer patients

圖3 miRNA 452?5P及miRNA215?5P ROC曲線及曲線下面積Fig.3 miRNA 452?5P and miRNA215?5P ROC curves and the area under the curve

表3 miRNA 215?5p表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征間關(guān)系Tab.3 miRN A215?5p expression and the relationship between the clinicopathological features of colorectal cancer patients

圖4 2?miRNAs panel ROC曲線及曲線下面積Fig.4 2?miRNAs panel ROC curves and the area under the curve

目前研究顯示結(jié)直腸癌中存在多個miRNA的差異表達，其與臨床病理特征、治療效果、診斷等均密切相關(guān)。在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者血漿中miR?122、miR?200a、miR?200b、miR?200c、miRNA?181c表達上調(diào)，miR?122水平增加與“不良”預后亞型相關(guān)，miRNA?181c可以預測Ⅱ期結(jié)直腸癌的復發(fā)，另外，所有miR?200家族成員均與患者的生存期，預后亞組、臨床特點相關(guān)，尤其miR?200c其可以獨立的預測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤復發(fā)以及預后［13-15］。

本研究結(jié)果提示miR?215?5P在結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)，說明其可以促進結(jié)直腸癌細胞增殖，轉(zhuǎn)移和侵襲，起到類似癌基因作用。miR?452?5P在結(jié)直腸癌組織中表達下調(diào)，說明其可以抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲等作用，在結(jié)直腸癌中起到類似抑癌基因的作用。我們通過與臨床病理資料分析，miR?452?5P與miR?215?5P表達與年齡、性別、分化程度、腫瘤位置、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織類型、Dukes分期等均無明顯關(guān)系（其原因可能是由于樣本量小、個體差異和腫瘤特性等因素有關(guān)）。但到目前為止miR?452?5P及miR?215?5P未見在結(jié)直腸癌相關(guān)報道，miR?452?5P及miR?215?5P在其他腫瘤中表達及機制很大程度上也還不清楚，特別是結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能存在新的調(diào)控機制及生物學作用。因此，我們將在今后的試驗中增大樣本量對miR?452?5P及miR?215?5P如何調(diào)控下游靶基因在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用進一步探討。

本研究繪制 miR?215?5P、miR?452?5PROC 曲線及曲線下面積AUC，結(jié)果顯示：miRNA452?5p曲線下面積為0.859，miRNA215?5p曲線下面積為0.879。并采用二元Logistic回歸分析方法將miRNA452?5p、miRNA215?5p引入回歸方程，構(gòu)建2?miRNAs panel，2?miRNAs panel曲線下面積為0.930，對結(jié)直腸癌診斷價值較高。本研究的研究對象為組織仍為有創(chuàng)檢查，下一步我們將研究結(jié)直腸癌患者外周血液中 miR?215?5P、miR?452?5P表達，期望探索出結(jié)直腸癌無創(chuàng)診斷價值的早期分子標志物。

綜上所述，本研究揭示miRNAs可以作為結(jié)直腸癌的重要生物學標記，其表達水平可以預測結(jié)直腸癌患者的預后，但是目前miRNAs對結(jié)直腸癌的診斷與治療在臨床上仍面臨著巨大的挑戰(zhàn)，不過隨著對miRNAs研究的深入，miRNAs很有可能成為新的腫瘤標志物，并可用于結(jié)直腸癌的診斷與治療。