閔家祺 鄔林泉

南昌大學第二附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科（南昌 330006）

肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC，以下簡稱肝癌）是世界范圍內(nèi)惡性腫瘤死亡率排名第三的癌癥［1］。其預后不良的主要原因是由于在根治性切除術(shù)后仍然有較高的復發(fā)率，并且缺乏有效的治療方法［2-4］。此外導致肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)病原因仍不明確。因此闡明導致肝癌轉(zhuǎn)移的機制是發(fā)現(xiàn)肝癌新的治療途徑和改善預后的關(guān)鍵。上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）是包括肝癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［5-6］。EMT的特征是上皮細胞標志物的降低和腫瘤細胞間充質(zhì)標志物的增加。研究報道肝癌細胞是可以通過EMT轉(zhuǎn)化來增加其侵襲和遷移能力的［7］。因此，研究EMT現(xiàn)象在肝癌發(fā)生發(fā)展中的潛在機制很有必要。

干擾素誘導跨膜蛋白3（IFITM3）是IFITM基因家族中的一員［8］。有研究報道IFITM3基因表達蛋白所發(fā)揮的功能與細胞的黏附作用、免疫細胞的調(diào)控等生長過程密切相關(guān)［9-10］。此外，IFITM3在結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌和食管鱗狀細胞癌中都呈現(xiàn)高表達［11-14］。并且，在結(jié)腸癌和胃癌中下調(diào)IFITM3的表達可以抑制癌癥細胞的侵襲轉(zhuǎn)移［15-16］。這些證據(jù)表明，IFITM3可以調(diào)控腫瘤的進展。然而，IFITM3在肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中所扮演的角色并不清楚，且其與EMT現(xiàn)象之間的關(guān)系也并不明確。因此，本研究旨在首次探討IFITM3的表達與臨床病理參數(shù)及預后的關(guān)系，以及IFITM3與EMT在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)系，揭示IFITM3在肝癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料所有標本均來自于南昌大學第二附屬醫(yī)院2011年1月至2016年12月具有完整隨訪資料的105例原發(fā)性肝癌患者。所有患者均知情同意，開展實驗已獲得倫理委員會批準。

肝癌細胞株由上海生物細胞研究所提供，培養(yǎng)于含10%FBS的DMEM中，置于37℃，5%CO2細胞孵箱內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色、Western blot檢測、劃痕實驗和Transwell細胞侵襲遷移實驗免疫組化染色、Western blot檢測、劃痕實驗和Transwell實驗方法如前期實驗所述［17］。免疫組化實驗中，每張IHC染色圖片的染色強度和陽性細胞百分比由3位病理學家雙盲評分。染色強度被評為：0（陰性）、1（陽性）、2（強陽性）；陽性細胞百分比評分為：0（0%）、1（1% ～ 25%）、2（26% ～50%）、3（51% ～75%）、4（76% ～100%）。所得兩組分數(shù)相乘即為總分（范圍為0～8），定義小于4分為IFITM3低表達組，高于4分為IFITM3高表達組。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成根據(jù)OMGA公司提供的總RNA提取試劑盒使用離心柱法提取105例癌與癌旁組織的總RNA，和肝癌細胞株的總RNA。檢測RNA溶液的濃度和純度和完整性后，將模板RNA按照TakaRa公司qRT?PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明配置且進行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20℃保存。

1.2.3 qRT?PCR測定使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，按說明書體系進行配置。

IFITM3 引物序列：上游：5′?ACTGTCCAAAC?CTTCTTCTCTCC?3′，下游：5′?TCGCCAACCATCT?TCCTGTC?3′。

GAPDH 引物序列：上游：5′?CAGGGCTGCT?TTTAACTCTGGT?3′，下游：5′?GATTTTGGAGGGAT?CTCGCT?3。

用ABI 7500熒光PCR儀進行熒光定量PCR測定IFITM3的mRNA表達水平，反應條件為95℃30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，60℃收集熒光，共進行40個循環(huán)。實驗結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參對照，使用2-ΔΔCT計算CT值。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析。使用Studentt檢驗、χ2檢驗、Log?rank檢驗進行數(shù)據(jù)分析，使用Kaplan?Meier計算總體生存率和無瘤存活率，Cox回歸進行單、多因素分析。所有統(tǒng)計采用雙側(cè)概率檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。本研究中的所有實驗均重復3次。

2 結(jié)果

2.1 IFITM3在肝癌組織學標本中高表達通過Western blot方法檢測105例入組患者癌與癌旁組織學標本，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中IFITM3蛋白表達量明顯較高（圖1A）。免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)肝癌組織中IFITM3高表達75例（71.4%），癌旁組織中IFITM3呈高表達20例（19%）（圖1B）。Western blot實驗證實IFITM3在肝癌組織中的表達明顯高于對應癌旁組織（圖1C）。

2.2 IFITM3與肝癌的進展密切相關(guān)通過分析105例臨床患者的病例資料和隨訪，結(jié)合標本IF?ITM3的表達量發(fā)現(xiàn)：IFITM3的表達與肝癌衛(wèi)星灶形成、腫瘤包膜、血管侵襲性和TNM分期密切相關(guān)（P＜0.05）。見表1。此發(fā)現(xiàn)證實IFITM3高表達會促進肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移。隨后將105例患者標本按照前述免疫組化評分，根據(jù)IFITM3的表達量將患者分為兩組：高表達組69例，低表達組36例。利用Kaplan?Meier生存分析，發(fā)現(xiàn)IFITM3高表達組的總體生存率和無瘤生存率明顯低于IFITM3低表達組（P＜0.05）。見圖2。其次，通過Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)：IFITM3表達量、血管侵襲、衛(wèi)星灶以及腫瘤包膜情況是評價肝癌患者預后的獨立因素（P＜0.05；表 2、3）。這些數(shù)據(jù)提示：IFITM3是影響肝癌患者預后的潛在生物學標志。

2.3 IFITM3在肝癌細胞株中的蛋白和mRNA表達情況通過Western blot和qRT?PCR實驗檢測正常肝細胞株HL7702，肝癌細胞株Hep3B、SMCC7721、Huh?7、HCCLM3、MHCC97H 中 IFITM3的蛋白和mRNA表達量（圖3）。IFITM3的蛋白和mRNA的表達量在HCCLM3中最高，SMCC7721中最低，且在正常肝細胞株HL7702中低于各肝癌細胞株。

圖1 IFITM3在肝癌患者癌與癌旁的蛋白水平表達Fig.1 The IFITM3 protein expression in HCC tumor and adjacent normal tissues

圖2 IFITM3表達與總體生存率和無瘤生存率的關(guān)系Fig.2 Relationship between IFITM3 expression and overall survival rate and tumor free survival rate

圖3 IFITM3在正常肝細胞系和各株肝癌細胞系中的mRNA和蛋白表達情況Fig.3 The mRNA and protein expression of IFITM3 in HL 7702 cell line and HCC cell lines

表1 105例患者IFITM3表達水平與肝癌臨床病理指標間的關(guān)系Tab.1 Correlation between the expression of IFITM3 in 105 HCC tissues and their clinicopathological characteristics 例

表2 肝癌臨床病理指標單因素生存分析Tab.2 Univariate survival analysis of OS and DFS in105 patients with HCC

表3 肝癌臨床病理指標多因素生存分析Tab.3 Variate survival analysis of OS and DFS in 105 patients with HCC

2.4 IFITM3誘導上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化分別在IFITM3表達量最高和最低的肝癌細胞株HCCLM3和SMCC7721中轉(zhuǎn)染干擾片段shIFITM3?3和過表達質(zhì)粒 pcDNA3.1（+）?IFITM3。通過 Western blot和qRT?PCR明確過表達和抑制后的效果（圖4 A、B）。然后，觀測抑制和過表達IFITM3表達后對EMT標記物的影響（圖4 C）。發(fā)現(xiàn)沉默IFITM3后，E?cadherin表達量增加，Vimentin和Snail表達量降低；而過表達IFITM3后，結(jié)果相反。表明IFITM3可以誘導肝癌發(fā)生EMT。

2.5 IFITM3促進肝癌侵襲轉(zhuǎn)移最后，利用Transwell實驗和劃痕實驗觀測過表達和抑制IF?ITM3表達對細胞侵襲和遷移能力的影響（圖5 A、B）。發(fā)現(xiàn)提高IFITM3的表達可以促進肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而降低其表達則可抑制。證實，IF?ITM3可以誘導肝癌發(fā)生EMT，從而促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。

3 討論

癌癥轉(zhuǎn)移是導致肝癌患者治療失敗和預后不良的首要原因［15］。而癌癥的發(fā)生發(fā)展是一個包括了細胞蛋白水解，腫瘤細胞侵襲和遷移，血管的生成的復雜變化過程［16］。在其中，EMT就是腫瘤發(fā)生侵襲遷移的重要一環(huán)［17］。因此，了解肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的機制，是發(fā)現(xiàn)肝癌新的治療途徑和改善預后，提高肝癌患者生存率的關(guān)鍵。

圖4 IFITM3誘導上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化Fig.4 IFITM3 induced epithelial?mesenchymal transition

圖5 IFITM3促進肝癌侵襲轉(zhuǎn)移Fig.5 IFITM3 promotes HCC invasion and metastasis

IFITM3基因是屬于IFITM家族中的一員。在多種惡性腫瘤中IFITM3的表達都有升高，如：結(jié)腸癌、食管癌、乳腺癌和胃癌等［12-13］。研究表明，IFITM3的表達在結(jié)腸癌中至關(guān)重要，它是調(diào)控結(jié)腸癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素［11-12］。同時，IFITM3在乳腺癌中的表達也與侵襲轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，并且降低乳腺癌中IFITM3的表達可以降低腫瘤細胞的增殖能力，并導致G0/G1細胞周期阻滯［18］。然而，IFITM3在肝癌中的表達和功能還不是很明確。本研究首次發(fā)現(xiàn)，IFITM3相對于癌旁組織，在肝癌組織中的蛋白和mRNA的表達量明顯增高。且，IFITM3的表達與腫瘤的衛(wèi)星灶發(fā)生，腫瘤包膜、血管侵襲能力、TNM分期密切相關(guān)。Kaplan?Meier生存分析顯示，相對于低表達組，IFITM3高表達的肝癌患者總體生存率和無病生存率均明顯下降，說明IFITM3表達上升是不良的預后因子。同時，Cox回歸單因素和多因素分析顯示：IFITM3的表達、腫瘤衛(wèi)星灶、腫瘤包膜和血管侵襲是影響肝癌患者生存率的獨立危險因素。

為了探討IFITM3對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，本研究更進一步通過RNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、Transwell和細胞劃痕實驗證實：IFITM3可以促進肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。并且首次發(fā)現(xiàn)，IFITM3的表達與E?cadherin呈負相關(guān)，與Vimentin和Snail的表達呈正相關(guān)，這些結(jié)果表明：在體外實驗中IFITM3可以誘導EMT的發(fā)生從而調(diào)控肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，本研究首次證實了IFITM3在原發(fā)性肝癌中呈高表達，可作為腫瘤侵襲潛能的預測指標，IFITM3的高表達伴隨著肝癌更低的生存率，增加了癌癥發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的危險。其次，IF?ITM3可以誘導EMT的發(fā)生，從而促進肝癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。這些發(fā)現(xiàn)為進一步研究IFITM3是如何通過EMT促進肝癌侵襲轉(zhuǎn)移奠定了理論基礎，為后續(xù)研究IFITM3促進肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的機制提供了有利證據(jù)。IFITM3將可能為原發(fā)性肝癌的基因治療提供有效的靶點和途徑，其作用值得進一步研究。