王鳳娟， 孫飛龍， 葉文文， 寧景葉

（西安工程大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，陜西西安 710048）

紅菊苣（Cichoricumintybusvar.foliosumHegi）是海水蔬菜的一種，又名軟化白菊苣、軟化、結(jié)球紅菊苣、結(jié)球綠菊苣等，葉球鮮紅色，為野生菊苣（CichoricumintybusL.）的變種（朱建星等，2017）。 目前對(duì)其栽培技術(shù)、總黃酮提取工藝以及綠原酸的研究較多，對(duì)紅菊苣中花青素的研究還不夠深入（王記蓮等，2015）?；ㄇ嗨厥亲匀唤缫活?lèi)廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類(lèi)化合物，也是水果、蔬菜、花卉中的主要呈色物質(zhì)（付輝戰(zhàn)等，2017）。由于不同植物所含有的細(xì)胞液pH不同，因此呈現(xiàn)出不同的顏色。在自然條件下很少存在游離狀態(tài)的花青素，其主要以糖苷—花色苷的形式存在（鄭紅巖等，2014）。 D'Evoli等（2012）利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)紅菊苣花青素進(jìn)行定性和定量分析，研究表明花青素具有消除自由基、降血脂、抗變異、延緩衰老、提高視力等生理活性。本文以酸性乙醇為提取劑，超聲輔助提取紅菊苣中的花青素，探討提取紅菊苣中花青素的提取工藝，為紅菊苣花青素提取工藝的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器 紅菊苣：將市售新鮮紅菊苣置于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥24 h后，粉碎，過(guò)60目篩，密封裝袋，備用；鹽酸、氯化鉀、乙酸鈉均為分析純；蒸餾水為實(shí)驗(yàn)室自制。

722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SK5200LH超聲波清洗儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；JBZ-100型高速多功能粉碎機(jī)，上海羅蘭德工貿(mào)有限公司；AL204型電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；DGF-1AB型立式電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠(chǎng)；三用電熱恒溫水箱，天津市泰斯特儀器有限公司；酸度計(jì)，上海任氏電子有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 技術(shù)路線(xiàn) 紅菊苣原材料→超聲波輔助乙醇提取→單因素試驗(yàn)→響應(yīng)面優(yōu)化→抽濾→吸光值測(cè)定

1.2.2 試劑配制

pH=1.0 的緩沖溶液：0.2 mol/L KCl∶0.2mol/L HCl=25∶67，V/V；

pH=4.5 的緩沖溶液：0.2 mol/L NaAc·3H2O∶0.2 mol/L HAc（楊萍，2017）。

1.2.3 紅菊苣中花青素的測(cè)定 根據(jù)花色苷特有性質(zhì)，本試驗(yàn)采用pH示差法測(cè)定花青素的含量（涂宗財(cái)?shù)龋?011），移取2.5 mL待測(cè)液定容到25 mL容量瓶中，取稀釋后的待測(cè)液2 mL，加入pH為 1.0、4.5的緩沖液 8 mL，30℃水浴平衡30 min，以蒸餾水作為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定花青素在520 nm和700 nm處的吸光值，以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷計(jì)，利用Fuleki公式對(duì)待測(cè)液中花青素含量進(jìn)行測(cè)定（Fuleki，2010）。

式中：V為提取液總體積，mL；DF為稀釋倍數(shù)；M-Cy-3-Glu（矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷）的相對(duì)分子質(zhì)量，449.2 g/mol；ε-Cy-3-Glu 的 消光系數(shù) ，29600 L/mol/cm；m 為樣品質(zhì)量，g；L 為光程，數(shù)值為1 cm。

1.3 紅菊苣中花青素提取的單因素試驗(yàn) 分別考慮不同液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，使用pH示差法對(duì)花青素含量進(jìn)行測(cè)定，確定最佳提取因素。每個(gè)試驗(yàn)平行三次。

1.3.1 液固比的確定 稱(chēng)取6份一定質(zhì)量的紅菊苣于錐形瓶中，按液固比（mL：g）為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 與 70%酸性乙醇（含 0.1%鹽酸）混勻，在200W、40kHz條件下避光超聲30 min，抽濾提取液，冷卻，將濾液轉(zhuǎn)至25 mL燒杯中作為待測(cè)液。按照1.2.3紅菊苣中花青素的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)的確定 依照1.3.1中的方法，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%對(duì)紅菊苣中花青素提取量的影響。

1.3.3 超聲提取時(shí)間的確定 依照1.3.1中的方法， 分析超聲時(shí)間為 20、30、40、50、60、70 min 對(duì)紅菊苣中花青素提取量的影響。

1.4 響應(yīng)面法優(yōu)化紅菊苣中花青素的提取條件根據(jù)單因素試驗(yàn)對(duì)液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間進(jìn)行綜合考慮，采用三因素三水平響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，分析紅菊苣花青素在不同提取條件下的含量，從而優(yōu)化出最佳提取條件（王鳳娟等，2017；Zhao等，2015）。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 中心組合Box-Behnken因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 液固比對(duì)紅菊苣中花青素提取量的影響從圖1可以看出，隨著液固比的增加，花青素提取量也增加，并在液固比為40∶1時(shí)，花青素提取量最多。繼續(xù)增加液固比，花青素提取量減少，因?yàn)樵谝欢ㄌ崛囟认?，花青素的溶解度是一定的，因此隨著提取溶劑的增加，花青素提取量也增加，當(dāng)提取劑達(dá)到某一值時(shí)，花青素不再溶解，此時(shí)再增加溶劑體積，不僅增加成本，而且使其雜質(zhì)含量也增加，故選擇液固比為40∶1為宜（武中庸等，2017）。

圖1 液固比對(duì)花青素提取量的影響

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅菊苣中花青素提取量的影響 從圖2可以看出，花青素提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而增加，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)達(dá)到最大，之后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而減少，主要原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)越大，提取劑極性越大，導(dǎo)致花青素溶解度下降，故乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)選擇70%。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素提取量的影響

2.3 超聲提取時(shí)間對(duì)紅菊苣中花青素提取量的影響 從圖3可以看出，初始時(shí)，超聲提取時(shí)間越長(zhǎng)花青素提取量越高，當(dāng)超聲提取時(shí)間為30 min時(shí)花青素的提取量最高，隨后呈下降趨勢(shì)。由于超聲波的空化效應(yīng)和機(jī)械作用會(huì)破壞花青素結(jié)構(gòu)，并且隨著超聲時(shí)間增長(zhǎng)提取溫度相應(yīng)的升高，高溫會(huì)導(dǎo)致花青素分解，降低提取量。故超聲提取時(shí)間為30 min。

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)花青素提取量的影響

3 響應(yīng)面法優(yōu)化紅菊苣中花青素的提取工藝研究結(jié)果

3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 利用Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)分析，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多元回歸擬合，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。擬合的多元回歸方程為：Y＝908.58+1.73A+6.58B-14.52C+28.20AB-25.60AC-4.75BC-58.06A2-40.38B2-45.96C2。整體模型顯著性水平P＜0.0001，表明二次方程模型達(dá)到極度顯著水平；回歸方程的相關(guān)系數(shù) （R2＝0.9886，Adj-R2＝0.9739，Pred-R2＝0.8522）及變異系數(shù) CV（0.98%）均表明模型方程能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。因此，可以用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析及預(yù)測(cè)。從表3可以看出，超聲提取時(shí)間一次項(xiàng)以及液固比、超聲功率、提取時(shí)間的二次項(xiàng)，以及液固比和乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互項(xiàng)、液固比和超聲提取時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響都達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），響應(yīng)值的變化較復(fù)雜，各個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，而應(yīng)呈二次拋物面關(guān)系。從各變量顯著性檢驗(yàn)P的大小，可以得出所研究各因素對(duì)紅菊苣中花青素提取效果影響大小順序依次為超聲提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液固比。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

3.2 交互項(xiàng)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響 三維響應(yīng)面圖可更直觀(guān)的看出兩因素對(duì)因變量的影響情況，可以直接找出最優(yōu)范圍，三維響應(yīng)面在底面的投影圖即為二維等高線(xiàn)圖，響應(yīng)面坡度越平緩，外界影響條件對(duì)其影響越小，響應(yīng)值的大小變化越小。比較分析圖4～圖6兩兩交互作用大小依次為液固比和乙醇體積分?jǐn)?shù)，液固比和超聲提取時(shí)間，乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲提取時(shí)間。

圖4 液固比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

圖5 液固比和超聲提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響

3.3 紅菊苣中花青素提取最優(yōu)工藝及其驗(yàn)證經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，確定的最優(yōu)提取條件為液固比40.86∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)為71.22%，超聲提取時(shí)間為28.12 min，花青素的提取量為910.426 mg/100g。為了操作方便，將上述條件修正為液固比41∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，超聲提取時(shí)間28 min，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，花青素提取量為908.596 mg/100 g，RSD為0.1%，與理論值相比誤差為1.83 mg/100 g。

4 結(jié)論

采用超聲波輔助提取紅菊苣中花青素，通過(guò)以液固比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲提取時(shí)間為提取單因素，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行三因素三水平的優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)。分析結(jié)果表明，3個(gè)因素中對(duì)花青素提取量影響大小為超聲提取時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液固比。最佳提取工藝為液固比41∶1，乙醇體積分?jǐn)?shù)71%，超聲提取時(shí)間28 min，在此條件下，花青素的提取量為908.596 mg/100 g，與模型中預(yù)測(cè)值910.426 mg/100 g相差不大，模型可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。