王 瑋

(安陽師范學(xué)院，河南 安陽 455000)

研究證明，糖尿病患者骨代謝易紊亂，常常并發(fā)糖尿病骨質(zhì)疏松(DOP)，其骨折和致殘性較高。目前關(guān)于DOP問題，大都從高血糖環(huán)境、糖基化終末期產(chǎn)物、胰島素、微量元素等角度入手進(jìn)行防治〔1，2〕；而對(duì)于肥胖型糖尿病患者，也有從瘦素、脂聯(lián)素的角度入手〔3〕。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是一種多潛能成體干細(xì)胞，在一定的誘導(dǎo)條件下，MSCs具有向成骨細(xì)胞分化的功能〔4〕。本研究從骨髓MSC(BMSC)的角度入手，旨在探究糖尿病大鼠BMSC向成骨細(xì)胞分化能力的改變，同時(shí)觀察中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)糖尿病大鼠BMSC的成骨誘導(dǎo)能力是否存在有影響，為運(yùn)動(dòng)干預(yù)DOP提供一定參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1動(dòng)物建模與分組 40只6周齡雄性清潔級(jí)SD大鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。按體重分層分為對(duì)照組(n=8)和糖尿病建模組(n=32)。對(duì)照組用普通飼料喂養(yǎng)；糖尿病建模組用高脂飼料(飼料配方：2.5%膽固醇，1%膽酸鈉，10%白糖，10%豬油，66.5%普通飼料)喂養(yǎng)8 w后以30 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)建糖尿病模型。注射STZ后的第3天和第7天測(cè)空腹血糖，空腹血糖>11.1 mmol/L視為建模成功，將建模失敗的大鼠(n=15)剔除。隨后將建模成功的大鼠按體重分層分為糖尿病組(n=9)和糖尿病運(yùn)動(dòng)組(n=8)，均改為普通飼料喂養(yǎng)。

1.2運(yùn)動(dòng)方案 糖尿病運(yùn)動(dòng)組參照Petzinger等〔5〕進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)，跑臺(tái)坡度為0°，每周運(yùn)動(dòng)6 d，周日休息，運(yùn)動(dòng)方案為第1周15 m/min 30 min、第2周15 m/min 60 min、第3周20 m/min 60 min、第4周20 m/min 90 min。

1.3動(dòng)物取材 運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，于處死當(dāng)天稱重。乙醚麻醉，大鼠心臟取靜脈血死亡，每組取5只右側(cè)脛骨提取BMSC，加2 ml紅細(xì)胞裂解液，進(jìn)行破紅處理。其中2只右腿脛骨的細(xì)胞以每孔5×106的密度鋪于6孔板上，利用平板計(jì)數(shù)法(CFU)檢測(cè)其增殖情況；3只右腿脛骨BMSC分別種至大皿中，體外分離培養(yǎng)，7 d后提取BMSC 中總RNA用RT-PCR法檢測(cè)Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2、核因子κB受體活化因子(RANK)和RANK配體(L)mRNA的表達(dá)。

1.4CFU形成實(shí)驗(yàn)和堿性磷酸酶(ALP)染色 細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，培養(yǎng)基由低糖換成成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液；培養(yǎng)2 d后，將6孔板從溫箱取出，1×磷酸鹽緩沖液(PBS)洗兩次，4%多聚甲醛(PFA)固定20 min后，1×PBS洗3次，避光加ALP染料30 min后，1×PBS洗一次，加1×PBS后進(jìn)行掃描。

1.5BMSC Runx2、RANK和RANKL mRNA定量檢測(cè) 將種植于大皿的BMSC 7 d后按照RNA的提取步驟，提取RNA。經(jīng)過酶標(biāo)儀檢測(cè)出每個(gè)樣本RNA的純度和濃度后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用試劑盒，對(duì)樣本中Runx2 mRNA、RANK mRNA和RANKL mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)。在Pubmed數(shù)據(jù)庫查詢大鼠Runx2、RANK、RANKL和GAPDH基因引物序列，后用Primer Express3.0 軟件檢測(cè)引物(表1)，引物由谷歌生物公司合成。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。

表1 RT-PCR 引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組體重比較 建模成功開始運(yùn)動(dòng)時(shí)，糖尿病組、糖尿病運(yùn)動(dòng)組體重與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但糖尿病組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；1 w后，糖尿病組體重較對(duì)照組顯著偏低(P<0.01)，糖尿病組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組之間仍未出現(xiàn)差異；2 w后各組體重和1 w后的結(jié)果一致；3 w后，糖尿病組體重較對(duì)照組顯著偏低(P<0.01)，糖尿病組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組體重出現(xiàn)差異，糖尿病運(yùn)動(dòng)組偏低(P<0.05)；4 w跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)結(jié)束后，糖尿病組體重較對(duì)照組顯著偏低(P<0.01)，糖尿病組和糖尿病運(yùn)動(dòng)組無顯著差異(P>0.05)。見表2。

2.2CFU形成實(shí)驗(yàn)和ALP染色 糖尿病運(yùn)動(dòng)組6孔板的成骨細(xì)胞數(shù)目最多，并且顯著多于糖尿病組，表明運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)糖尿病組BMSC體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞。見圖1。

表2 各組體重比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與糖尿病組比較：3)P<0.05

2.3BMSC Runx2、RANK和RANKL mRNA的定量檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，糖尿病組Runx2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)；與糖尿病組相比，糖尿病運(yùn)動(dòng)組Runx2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。與對(duì)照組相比，糖尿病組RANK、RANKL mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；與糖尿病組相比，糖尿病運(yùn)動(dòng)組RANK mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。見表3。

圖1 各組BMSC ALP染色

組別nRunx2RANKRANKL對(duì)照組80.126 7±0.058 90.001 6±0.000 70.000 1±0.000 0糖尿病組90.033 6±0.039 31)0.121 1±0.131 62)0.003 1±0.004 21)糖尿病運(yùn)動(dòng)組80.180 7±0.092 34)0.001 5±0.000 34)0.000 0±0.000 03)

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與糖尿病組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

轉(zhuǎn)錄因子Runx2是成骨細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，能激活和啟動(dòng)BMSC向成骨細(xì)胞系分化，同時(shí)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的分化和功能，對(duì)骨組織的形成和骨重建起著至關(guān)重要作用〔6〕；RANKL/RANK/骨保護(hù)素(OPG)信號(hào)通路在成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的通訊中起著關(guān)鍵作用，成骨細(xì)胞通過改變OPG和RANKL的合成，從而間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和成熟。RANK結(jié)合RANKL能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化及成熟。但在這個(gè)過程中，OPG作為一種誘餌受體，可以阻斷RANK和RANKL結(jié)合，骨吸收和骨形成達(dá)到平衡的關(guān)鍵就在于RANKL/OPG比值〔7〕。OPG含量低，RANKL/OPG比值高則有利于骨吸收。

本研究表明運(yùn)動(dòng)可以降低糖尿病大鼠的體重。糖尿病患者體內(nèi)胰島素都存在分泌失調(diào)或作用障礙，胰島素分泌不足可造成骨代謝紊亂，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，并且胰島素水平越低，骨代謝異常越明顯。胰島素可直接刺激成骨細(xì)胞，促進(jìn)其細(xì)胞內(nèi)氨基酸蓄積、骨膠原及骨基質(zhì)的合成分泌。OPG由成骨/基質(zhì)細(xì)胞旁分泌的可溶性因子，在破骨細(xì)胞增殖及分化中起關(guān)鍵作用。當(dāng)胰島素分泌不足，OPG水平會(huì)降低，RANKL/OPG的比值升高將有利于骨吸收〔2，8〕。胰島素還可通過抑制腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)合成，減少促進(jìn)骨吸收〔9〕，抑制高血糖對(duì)BMSCs的毒性作用促進(jìn)骨吸收等〔10〕。運(yùn)動(dòng)可提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗〔11〕。原因可能是提高了糖原合成相關(guān)酶的活性和數(shù)量、改善胰島素受體后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，上調(diào)肌肉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等機(jī)制來提高胰島素敏感性〔12〕。但是程守科等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)，劇烈運(yùn)動(dòng)后短時(shí)間內(nèi)胰島素的敏感性下降，運(yùn)動(dòng)中過度氧化是胰島素敏感下降的重要原因。

同時(shí)，肥胖會(huì)刺激瘦素分泌，分泌過多則又易導(dǎo)致瘦素抵抗，同時(shí)引起脂聯(lián)素的水平下降。瘦素和脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞中兩大重要細(xì)胞因子，其參數(shù)水平異常則導(dǎo)致骨代謝異常。外周血和組織中瘦素直接作用于相關(guān)細(xì)胞(譬如BMSCs)刺激骨形成，通過RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)抑制骨吸收〔14〕。衣雪潔等〔15〕發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練可明顯降低體脂和血瘦素水平，上調(diào)脂肪的瘦素受體的基因表達(dá)，有效地緩解瘦素抵抗，中等強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)也可明顯增加血液脂聯(lián)素水平〔16〕。而一次性急性運(yùn)動(dòng)對(duì)瘦素和脂聯(lián)素水平改善沒有顯著作用。

BMSC來源于中胚層——四肢骨骼，是存在于骨髓基質(zhì)中的一種多能干細(xì)胞，屬于成體干細(xì)胞。連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后具有多向分化潛能。在一定的微環(huán)境或培養(yǎng)條件下，BMSCs可分化為軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種間充質(zhì)細(xì)胞。在體外特定的誘導(dǎo)條件下，BMSCs還可跨越胚層界限，向內(nèi)胚層和神經(jīng)外胚層來源的多種組織細(xì)胞分化。骨細(xì)胞生理的一個(gè)重要特點(diǎn)就是破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收與成骨細(xì)胞介導(dǎo)的新骨形成之間的聯(lián)系。破骨細(xì)胞(骨吸收)是多核細(xì)胞來源于肝星狀細(xì)胞譜系中的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞；成骨細(xì)胞，骨基質(zhì)沉淀鈣化和脂肪細(xì)胞都來源于BMSC，骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞增加可影響成骨細(xì)胞的分化和功能，增加破骨細(xì)胞活性，影響骨礦化〔17〕。高血糖會(huì)抑制BMSC向成骨細(xì)胞的分化〔11〕。本次研究與上述的研究一致；表明糖尿病會(huì)抑制大鼠BMSC向成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)破骨形成。高血糖環(huán)境對(duì)某些骨代謝信號(hào)產(chǎn)生影響，會(huì)使Wnt/β-catenin和RANKL/RANK/OPG信號(hào)通路失調(diào)〔18〕。

細(xì)胞能增殖再生意味著有生存能力，但貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必須為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。本文結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)可以改善糖尿病大鼠BMSC向成骨細(xì)胞分化的能力；運(yùn)動(dòng)可以抑制糖尿病大鼠BMSC向破骨細(xì)胞分化的能力。OPG-RANKL-RANK 系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能發(fā)揮的一個(gè)重要信號(hào)通路，還是聯(lián)系成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間通訊的重要紐帶〔19〕。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動(dòng)可能會(huì)影響B(tài)MSC向成骨細(xì)胞分化的潛能，這與先前的研究相一致〔20～22〕。研究報(bào)道，運(yùn)動(dòng)可以增加小鼠血清雄激素水平，增加抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收的細(xì)胞因子水平〔23〕。此外，運(yùn)動(dòng)過程中應(yīng)力的刺激通過相關(guān)信號(hào)通路〔轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、Wnt〕對(duì)BMSC向成骨細(xì)胞分化產(chǎn)生影響〔24〕。應(yīng)力的刺激對(duì)BMSC向成骨細(xì)胞分化主要體現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度及運(yùn)動(dòng)持續(xù)的時(shí)間上，當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)時(shí)，運(yùn)動(dòng)不利于BMSC向成骨細(xì)胞分化，其原因可能是造成了細(xì)胞機(jī)械磨損，從而阻礙了相關(guān)的信號(hào)通路〔25〕。運(yùn)動(dòng)時(shí)本身由于需氧量的增加引起氧化應(yīng)激，釋放活性氧(ROS)，低劑量ROS可以促進(jìn)相關(guān)信號(hào)通路(MAPK)，使成骨細(xì)胞增殖分化，中等劑量則會(huì)使其短暫或永久地停止生長(zhǎng)，而大劑量則會(huì)使其凋亡壞死〔26〕。ROS含量與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、時(shí)間密切相關(guān)。長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)時(shí)，需要更多的氧氣，因此ROS含量也會(huì)越高。如果ROS不能被及時(shí)清除，不利于成骨細(xì)胞的分化。此外，急性劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，機(jī)體抗氧化系統(tǒng)也是不足以平衡氧化系統(tǒng)，從而造成ROS過剩。本文結(jié)果證實(shí)，中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)是可以改善糖尿病鼠BMSC向成骨細(xì)胞的分化能力。