邵 凱 宿建麗 劉騫文 趙曉云

(山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中心，山東 青島 266000)

肥胖時(shí)脂肪組織擴(kuò)張導(dǎo)致脂肪細(xì)胞肥大和數(shù)量增生，從而誘導(dǎo)葡萄糖和脂類代謝失調(diào)。而脂肪組織增加破壞了機(jī)體能量平衡，提高了胰島素抵抗(IR)、高血壓和血脂異常的風(fēng)險(xiǎn)。正確理解脂肪細(xì)胞的分化將提供有價(jià)值的信息，有助于全面有效治療肥胖策略的制定。脂肪細(xì)胞的分化發(fā)生在幾個(gè)不同階段，涉及許多信號(hào)通路，其關(guān)鍵是一系列嚴(yán)格控制的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。過氧物酶體增殖物激活受體(PPAR)屬于核受體超家族成員，與肥胖及脂代謝相關(guān)疾病的發(fā)生關(guān)系密切。PPARα和脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP)2被稱為脂肪細(xì)胞的分化標(biāo)記。此外，最新研究報(bào)道小分子核糖核酸(miRNA)參與了脂肪細(xì)胞的分化〔1，2〕。miRNA是19～22個(gè)核苷酸非編碼RNA的碎片，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控目標(biāo)靶基因，在不同的生理過程中扮演了重要的角色。研究表明，miRNA在能量代謝〔3〕，糖和脂代謝〔4〕，胰島素分泌〔5〕和脂肪細(xì)胞分化〔6，7〕等過程中都發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)miR-152在小鼠的3T3-L1細(xì)胞分化過程中表達(dá)明顯上調(diào)，引入反義寡核苷酸的miR-152，可抑制脂聯(lián)素基因的表達(dá)，提示miR-152在前脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用〔2〕。然而，脂肪細(xì)胞分化過程中miR-152 表達(dá)改變及其分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究檢測(cè)3T3-L1細(xì)胞分化過程中miR-152和PPAR信號(hào)系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討肥胖的發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞(購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和Trizol等由美國(guó)Invitrogen公司提供，胰島素、葡萄糖、地塞米松、1-甲基-3-異丁基黃嘌呤(MIX)和油紅O染料由Sigma公司提供，轉(zhuǎn)錄試劑盒、miR-152特異引物和熒光定量PCR試劑盒由美國(guó)ABI公司提供。

1.23T3-L1前體脂肪細(xì)胞培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)接種于培養(yǎng)板，使用完全培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+100 U/ml青、鏈霉素)，在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%二氧化碳，95%空氣)中進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d換液1次。觀察細(xì)胞生長(zhǎng)完全融合2 d后，加入分化誘導(dǎo)液，培養(yǎng)2 d，換只含2 μmol/L胰島素的完全培養(yǎng)基，再培養(yǎng)2 d，換成不加任何誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)基，以后每2 d換液1次，直至第9天培養(yǎng)至85%～95%的3T3-L1細(xì)胞都分化為成熟脂肪細(xì)胞，用油紅O染色細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量亮紅色脂肪滴，提示3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化成功。分別收集誘導(dǎo)分化第0天、3天、6天和9天的培養(yǎng)細(xì)胞待檢。

1.3熒光定量PCR檢測(cè) 應(yīng)用miRNA提取試劑盒(美國(guó)ABI 公司)提取附睪脂肪miRNA，應(yīng)用miR-152特異反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增，引物均在美國(guó)ABI 公司合成。miR-152反轉(zhuǎn)錄引物序列：miR-152：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-CCAAGT-3′;U6：5′GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACA-AAATATG-3′。miR-152定量PCR引物：U6：5′-GCGCGTCGTGAAGC GTTC-3′；miR-152:5′-TCAGTGCATGACAGA-3′;通用引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。使用Trizol一步法提取各組脂肪細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qPCR引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成，PPARγ上游5′-CCCACCAACTTCGGAATCAG-3′,下游5′-TGCTGGAG-AAATCAACTGTGGTA-3′；aP2上游5′-GTGATGCCTTTGTGGGAACCTGGAAG-3′，下游5′-GTGATGCCTTTGT-GGGAACCTGGAAG-3′;PPARα上游5′-TGAACAAAGA-CGGGATG-3′，下游5′-TCAAACTTGGGTTCCATG-AT-3′;GAPDH上游5′-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3′，下游5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3′。于ABI 公司Prism 7000熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，于72℃ 延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，以限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù)(CT)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析、t檢驗(yàn)及直線相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1脂肪細(xì)胞分化過程中基因表達(dá)的改變 誘導(dǎo)6～9 d，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量亮紅色脂肪滴，提示3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化完成。分化過程0 d、3 d、6 d和9 d觀察期內(nèi)，miR-152表達(dá)量持續(xù)增加，至第6天達(dá)到峰值，PPAR-α、PPAR-γ和aP2表達(dá)量均呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)(表1)。

表1 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中各基因的表達(dá)量

與其他時(shí)間點(diǎn)比較：1)P<0.05

2.2miR-152與PPAR信號(hào)通路的相關(guān)性 脂肪細(xì)胞分化過程中miR-152表達(dá)增加，與PPARα基因表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.958，P<0.01)，與PPARγ和aP2基因上調(diào)也呈正相關(guān)(r=0.667，0.697，P<0.05)(圖1)。

圖1 3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程miR-152與各基因表達(dá)相關(guān)性

3 討 論

肥胖引起的脂肪細(xì)胞增生和肥大與各種代謝紊亂有關(guān)，研究脂肪形成和脂類代謝的分子機(jī)制非常重要。有研究表明 miRNA可以直接或間接調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化，miRNA可以作用于脂肪形成的各個(gè)要素，調(diào)控脂肪細(xì)胞分化關(guān)聯(lián)基因表達(dá)改變〔7〕，從而調(diào)控脂肪形成，調(diào)節(jié)脂類代謝〔8〕。此外，最近的研究提出有些miRNA可以作為肥胖的生物標(biāo)志物，但仍有許多問題有待解決。miRNA和目標(biāo)基因在脂肪形成的過程存在復(fù)雜交互作用，其機(jī)制尚未完全闡明，需要進(jìn)一步解釋這些miRNA的作用及其對(duì)脂肪形成的監(jiān)管機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)miR-152可能通過直接調(diào)節(jié)PPAR信號(hào)系統(tǒng)參與3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化過程。

基因差異性表達(dá)是細(xì)胞分化的本質(zhì)。前脂肪細(xì)胞可以在多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下，通過激活或抑制分化相關(guān)基因，經(jīng)過復(fù)雜的過程分化成為成熟脂肪細(xì)胞。PPAR信號(hào)通路是一類能被過氧化物酶體增殖物激活的受體，其包含多種亞型，其在機(jī)體葡萄糖和脂質(zhì)代謝平衡中發(fā)揮關(guān)鍵的作用〔1～3〕，能夠調(diào)節(jié)脂肪的分化形成。

研究指出，人皮下脂肪組織過表達(dá)miR-519d與嚴(yán)重肥胖有關(guān)〔8〕。miR-519能夠結(jié)合于PPARα的3′UTR。盡管在肥胖受試者中PPAR miRNA高度表達(dá)，但與對(duì)照組相比，其蛋白幾乎檢測(cè)不到。miRNA和蛋白之間的表達(dá)差異表明PPAR蛋白可能受到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。在脂肪生成過程中，miR-519d的激活呈現(xiàn)劑量依賴性，這表明miR-519d可能是脂肪細(xì)胞肥大的一個(gè)因素，引起肥胖人群脂肪組織的大規(guī)模增加。在肥胖或脂肪細(xì)胞分化中還未有miR-519d差異表達(dá)的報(bào)道。此外，在3T3-L1脂肪細(xì)胞中，miR-21能夠通過調(diào)控PTEN-AKT通路來逆轉(zhuǎn)高糖和高胰島素引起的IR，因此miR-21可以作為一個(gè)預(yù)防和治療IR和其他代謝疾病的新的潛在靶標(biāo)〔9〕。

在對(duì)肥胖脂肪細(xì)胞的不同研究中，由于細(xì)胞類型的多樣性使得對(duì)miRNA表達(dá)的解釋存在差異。有預(yù)測(cè)報(bào)道m(xù)iR-27a和miR-130可以特異性結(jié)合在PPAR3′UTR末端。依照這些預(yù)測(cè)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-27a和miR-130確實(shí)可以通過下調(diào)PPAR來抑制脂肪細(xì)胞的分化〔10，11〕。miR-27a和miR-130的表達(dá)水平在脂肪生成過程中逐漸減少，與PPAR的表達(dá)水平相反。過表達(dá)的miR-27a和miR-130 可能抑制了PPAR蛋白表達(dá)，從而抑制脂肪細(xì)胞的分化。而改變PPAR也會(huì)導(dǎo)致皮下和腹部脂肪組織中miRNA表達(dá)發(fā)生變化〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-152在小鼠的3T3-L1細(xì)胞分化過程中表達(dá)明顯上調(diào)，在前脂肪細(xì)胞引入反義寡核苷酸的miR-152，可抑制脂聯(lián)素基因的表達(dá)，這表明miR-152在脂肪細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮作用〔2〕。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞miR-152下調(diào)，損傷AKT/GSK途徑，參與肝臟IR發(fā)病〔12〕。然而，脂肪組織miR-152 在肥胖和IR的發(fā)病中的作用是未知的。本研究初步證實(shí)脂肪細(xì)胞分化過程中miR-152表達(dá)增加，直接上調(diào)PPAR、PPAR和aP2基因表達(dá)，參與肥胖發(fā)病呈正相關(guān)。miRNA表達(dá)譜的研究已經(jīng)鑒定出一些參與脂肪形成并與肥胖有關(guān)的miRNAs，但探尋這些miRNA在脂肪組織中參與調(diào)控的作用仍然面臨著挑戰(zhàn)〔8〕。因此，研究miRNA 的轉(zhuǎn)錄與生物的合成和降解間是否有平行的變化是非常有意義的，這可以解釋在肥胖中觀測(cè)到的異常調(diào)節(jié)的miRNA。此外，其他細(xì)胞外壓力和養(yǎng)分供應(yīng)調(diào)控肥胖相關(guān)的miRNA的作用還不清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)miRNA被分泌到細(xì)胞外液，建立一個(gè)血漿miRNA譜對(duì)于區(qū)分健康和肥胖受試者是十分重要的。潛在血漿miRNA表達(dá)譜可以應(yīng)用于肥胖管理和跟蹤治療。進(jìn)一步鑒定和表征與脂肪形成和肥胖相關(guān)的miRNA能夠提供新一代的治療方案和策略，推進(jìn)新的抗肥胖治療的發(fā)展。