朱英杰 王慕鵬 竭 晶 宋 磊 彭麗萍

(吉林大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是我國(guó)常見的慢性呼吸道疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，至 2020年COPD可能上升為世界第三大致死病因，成為我國(guó)最大的疾病負(fù)擔(dān)〔1〕。糖皮質(zhì)激素(GC)作為目前臨床上應(yīng)用廣泛且有效的抗炎癥藥物，在 COPD 治療過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而長(zhǎng)期的激素治療可能出現(xiàn)“糖皮質(zhì)激素抵抗”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其治療效果〔2〕。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶的一種主要多酚成分，綠茶的鐵鰲和、抗氧化、抗炎、抗癌及神經(jīng)保護(hù)等作用與 EGCG密切相關(guān)，而 EGCG對(duì) COPD患者是否具有促進(jìn)GC敏感性的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究以小鼠肺泡上皮細(xì)胞系MLE12細(xì)胞為研究對(duì)象，探討EGCG對(duì)煙草提取物(CSE)誘導(dǎo)的GC抵抗的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 清潔級(jí)C57/BL6小鼠由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心購(gòu)置；脂多糖、Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒為日本同仁公司；組蛋白去乙?；?HDAC)-2 抗體，美國(guó)Abcam公司；EGCG，長(zhǎng)沙三福生物科技有限公司。

1.2CSE制備 使用前30 min 準(zhǔn)備，將香煙點(diǎn)燃后，其過濾嘴一端連接橡皮管，橡皮管的另一端連接洗耳球。根據(jù)操作方式，提前測(cè)量洗耳球平均容量。準(zhǔn)備一只空的密閉瓶，含有10 ml DMEM培養(yǎng)基，吸取約300 ml的煙霧注入瓶中，搖勻，使煙霧融入DMEM中，即為原液〔3〕。

1.3COPD小鼠模型的建立 參照文獻(xiàn)〔4〕制作COPD小鼠模型。將脂多糖(LPS)配制成 1 mg/ml的溶液，4℃保存。造模開始第 1、14天將配制好的脂多糖溶液0.2 ml注入氣道內(nèi)，第2～13天、第15～28天，每日將小鼠放在60 cm×40 cm×50 cm的儲(chǔ)物箱中被動(dòng)吸煙，每次每籠小鼠1 h，5只小鼠/籠，2次/d，每次間隔4 h。將點(diǎn)燃的香煙放在鼠籠架上，讓小鼠被動(dòng)吸煙。COPD模型小鼠造模共28 d。

1.4小鼠肺泡灌洗液(BALF)的分離 COPD小鼠模型造模成功后，按照參考文獻(xiàn)〔4〕，取得COPD小鼠模型BALF，1 500 r/min離心10 min，細(xì)胞沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸，將重懸液分為對(duì)照組、CSE組、地塞米松(Dex)+CSE組、EGCG+CSE組、EGCG I+Dex+CSE組、EGCG Ⅱ+Dex+CSE組和EGCG Ⅲ+Dex+CSE組，使用實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)分別測(cè)定重懸細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)。

1.5EGCG對(duì)MLE12細(xì)胞活性影響的測(cè)定 分別使用5、10、50、100 μl EGCG刺激MLE12細(xì)胞，使用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活性(按照說明書操作)。

1.6MEL12細(xì)胞炎性因子mRNA測(cè)定 用LPS(500 ng/ml)處理18 h，用Trizol試劑分離細(xì)胞總RNA，按照說明書操作。分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度，通過Prime-Script RT-PCR將1 μg RNA轉(zhuǎn)化成cDNA。RT-PCR在0.2 ml PCR管中進(jìn)行，SYBR green染色劑，使用定制PCR主混合物95℃10 min，接著40個(gè)循環(huán)的95℃10 s，60℃ 30 s。用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化分析相對(duì)基因表達(dá)mRNA表達(dá)。

1.7MLE12細(xì)胞上清炎癥因子的測(cè)定 收集對(duì)照組、CSE組、Dex+CSE組、EGCG+CSE組、EGCG Ⅰ+Dex+CSE組、EGCG Ⅱ+Dex+CSE組和EGCG Ⅲ+Dex+CSE組細(xì)胞上清，使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試劑盒測(cè)定炎癥因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)量。

1.8Western印跡測(cè)定MLE12細(xì)胞中HACD-2蛋白表達(dá)量 將MLE12細(xì)胞分為對(duì)照組、CSE組、EGCG Ⅰ+CSE組、EGCG Ⅱ+CSE組和EGCG Ⅲ+CSE組，用HDAC-2抗體，采用Western印跡方法測(cè)定五組MLE12細(xì)胞中HDAC-2蛋白的表達(dá)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 軟件，多組間顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié) 果

2.1EGCG對(duì)MLE12細(xì)胞活性的影響 與對(duì)照組(設(shè)為1)相比，5、10、50、100 μmol/L EGCG刺激MLE12細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞的活性并無影響(分別為1.07±0.19，0.92±0.20，1.04±0.21，0.95±0.22，均P>0.05)。

2.2EGCG減輕CSE誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng) EGCG Ⅱ+Dex+CSE組和EGCG Ⅲ+Dex+CSE組MLE12細(xì)胞中及細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.3EGCG對(duì)COPD模型小鼠呼吸道中的炎癥反應(yīng)的影響 使用25 μl和100 μl EGCG與CSE同時(shí)作用BALF重懸細(xì)胞中細(xì)胞數(shù)明顯降低、巨噬細(xì)胞明顯升高、中性粒細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2，表3。

表1 各組BALF細(xì)胞總數(shù)、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞水平比較

與其余5組比較：1)P<0.01

表2 各組IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平比較

與其余5組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

表3 各組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平比較

與其余5組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

2.4EGCG促進(jìn)HDAC-2的活性 50 μl和100 μl EGCG與CSE同時(shí)作用于MLE12細(xì)胞，HDAC蛋白表達(dá)量顯著增加，而磷酸化HDAC-2(p-HDAC-2)蛋白表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見圖1，表4。

圖1 Western印跡測(cè)定HDAC-2及p-HDAC-2蛋白表達(dá)量

組別HDAC-2p-HDAC-2對(duì)照組1±0.261±0.17CSE組0.29±0.083.46±0.49CSE+EGCG Ⅰ組0.35±0.062.74±0.51CSE+EGCG Ⅱ組0.89±0.241)1.38±0.221)CSE+EGCG Ⅲ組1.17±0.311)1.34±0.271)

與其余3組比較：1)P<0.01

3 討 論

COPD是外界環(huán)境因素和宿主因素交互作用的結(jié)果，主要特征是持續(xù)氣流受限，且不完全可逆。氣道炎癥是COPD主要發(fā)病機(jī)制，由吸煙引起的慢性氧化應(yīng)激也在COPD發(fā)病中起重要作用，GC作為目前臨床上應(yīng)用廣泛的抗炎癥藥物，是治療COPD的重要藥物之一〔5〕，在 COPD 治療中發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而臨床上COPD患者對(duì)GC的敏感性遠(yuǎn)不如支氣管哮喘，沙特胸科協(xié)會(huì)的最新一項(xiàng)調(diào)查顯示，只有55%的被調(diào)查者認(rèn)為吸入GC能有效改善COPD患者的生活質(zhì)量〔6〕。長(zhǎng)期的激素治療，可能出現(xiàn)所謂的“GC抵抗”現(xiàn)象，增加了激素副作用的發(fā)生。GC抵抗的相關(guān)機(jī)制包括HDAC-2活性下降、GC受體異常、核因子(NF)-κB激活通路缺乏等〔7〕。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)模型中炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，而HDAC-2蛋白表達(dá)降低，推測(cè)COPD患者的GC抵抗與HDAC-2活性降低有一定的聯(lián)系，但具體調(diào)控通路，本課題組還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

近年來，中藥單體對(duì)COPD的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的研究日漸增多，可通過多途徑、多環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)，如黃芩苷通過抑制IL-1β、IL-8、IL-6和TNF-α等抑制COPD的炎癥反應(yīng)；穿心蓮內(nèi)酯很可能通過上調(diào)Nrf-2活性增加抗氧化基因表達(dá)從而對(duì)COPD有抑制作用〔8〕；姜黃素通過維持HDAC-2含量恢復(fù)GC類敏感性，從而可作為GC類聯(lián)合用藥治療COPD。EGCG是綠茶的一種主要多酚成分，通過增強(qiáng)抗氧化途徑抑制小鼠的狼瘡性腎炎；抑制人支氣管上皮細(xì)胞中煙草誘導(dǎo)的NF-κB激活；通過Nrf-2-Keap1通路增強(qiáng)抗氧化活性，抑制肺纖維化中的炎癥反應(yīng)，但EGCG是否可通過抗氧化進(jìn)而增加COPD病人對(duì)GC的敏感性還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，EGCG可顯著抑制煙草誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，如抑制炎癥反應(yīng)，增加COPD模型鼠中巨噬細(xì)胞量，降低中性粒細(xì)胞含量，并上調(diào)MLE12中HDAC-2含量，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用。這為進(jìn)一步研究其抗氧化作用機(jī)制及恢復(fù)COPD病人對(duì)GC類藥物敏感性奠定了基礎(chǔ)。