何前松 張亞洲 翁 檸 樊梓媛 胡斐然 馮 泳

(貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550001)

缺血性腦卒中是臨床上最為常見的腦血管疾病之一，其發(fā)病率高、致殘率高、致死率高、復(fù)發(fā)率高〔1〕。挽救、保護(hù)缺血半暗帶區(qū)(缺血灶邊緣區(qū))可逆的神經(jīng)元細(xì)胞是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)中風(fēng)病，運(yùn)用中醫(yī)藥防治中風(fēng)病的歷史悠久。錦雞兒根(又名金雀花根、板參、陽雀花根、土黃芪)，具有活血祛風(fēng)、補(bǔ)氣益腎之功，其主要藥效成分是錦雞兒總黃酮(TFC)，目前研究發(fā)現(xiàn)，錦雞兒總黃酮對腦缺血損傷有保護(hù)作用，可提高腦缺血損傷模型大鼠腦組織超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低丙二醛(MDA)含量；抑制血液黏度升高，降低血小板聚集，改善紅細(xì)胞變形能力〔2，3〕。研究證實錦雞兒根提取物具有顯著抗缺血缺氧、抗運(yùn)動疲勞等作用〔4，5〕，對腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用〔6〕，但其作用機(jī)制尚不清楚。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生在腦缺血后腦組織修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)中發(fā)揮重要作用〔7〕。本實驗觀察了腦缺血后缺血周邊區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)生長變化，TFC對大鼠腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)和神經(jīng)發(fā)生的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及藥品 雄性Wistar大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號： SCXK(京)2012-0001，體重(280±20)g。分籠飼養(yǎng)，自由飲水，飼養(yǎng)溫度為22～25℃，相對濕度40%～60%。藥品：取適量錦雞兒根提取總黃酮類化合物，采用紫外分光光度法檢測蘆丁含量達(dá)70.3%。

1.2試劑及儀器 免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋公司；兔抗GFAP多克隆抗體(美國，Santa Cruz)；5%BSA封閉液，TRITC 熒光二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；數(shù)控抗原熱修復(fù)儀(廣州深達(dá)生物制品技術(shù)有限公司)；切片機(jī)(LEICA，RM2135)；倒置熒光顯微鏡(德國LEICA公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-rad公司)；轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-rad公司)；電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.3實驗分組及給藥方法 取60 只大鼠，隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、TFC高、中、低劑量組每組12只，TFC高、中、低劑量組于腦缺血1.5 h再灌注3 h后，分別給予TFC(60 mg/kg、30 mg/kg、15 mg/kg)灌胃，假手術(shù)組及模型組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)治療14 d。

1.4腦缺血模型的制作 用3.5%異氟烷和30%氧氣混合氣體將大鼠麻醉，固定，面罩持續(xù)吸入3.5%異氟烷和30%氧氣混合氣體維持麻醉。參照文獻(xiàn)線栓法〔8〕制作大鼠腦缺血再灌注模型。在整個實驗過程中使用恒溫電熱板維持大鼠體溫在(37.0±0.5)℃。

1.5神經(jīng)功能缺損評分 參照文獻(xiàn)方法〔9〕評價大鼠腦缺血神經(jīng)功能缺損。評分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)功能缺損癥狀者0分；有輕度神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為不能完全伸展左側(cè)前爪者1分；有中度局灶性神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為向左側(cè)轉(zhuǎn)圈者2分；有重度局灶性神經(jīng)功能缺損，表現(xiàn)為向左側(cè)傾倒者3分；不能自發(fā)行走，表現(xiàn)有意識水平下降者4分。2～4分者入選，觀察大鼠腦缺血后24 h和治療第14天后神經(jīng)功能缺損評分。

1.6HE染色觀察大鼠缺血周邊區(qū)腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 大鼠腦缺血治療14 d，末次給藥后2 h用水合氯醛(0.3 ml/100 g體重,腹腔注射) 將大鼠麻醉，剖開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室向升主動脈插管，剪開右心耳，用預(yù)冷的生理鹽水速灌沖洗，直至流出液體變清為止；再用預(yù)冷的4%多聚甲醛( 0.1 mol/L PBS 配制，pH值7.4)100 ml緩慢灌注固定；取出腦組織，放于4%多聚甲醛中固定48 h。取出腦組織脫水、常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，在光鏡下觀察缺血周邊區(qū)腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.7免疫熒光法觀察缺血周邊區(qū)GFAP表達(dá) 免疫熒光組織化學(xué)染色檢測大鼠缺血半暗帶區(qū)GFAP的表達(dá)。取上述腦片，GFAP多克隆抗體(1∶200)，TRITC 熒光二抗，5%BSA封閉液，孵育，4℃過夜。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件在400 倍視野下選取相應(yīng)區(qū)域3 個不重疊視野檢測陽性染色部位的積分光密度(IOD) 值。按平均IOD=IOD/面積計算，實驗重復(fù)6次取其平均值表示GFAP的相對表達(dá)量(n=6)。

1.8Western印跡檢測大鼠缺血半暗帶區(qū)GFAP蛋白表達(dá) 取缺血半暗帶區(qū)腦組織100 mg，加入蛋白裂解液，勻漿，4℃ 12 000 r/min，10 min，取上清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后調(diào)整樣品濃度。取50 μg蛋白樣品上樣，進(jìn)行電泳(濃縮膠恒壓80 V，約40 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍(lán)到凝膠底部)、轉(zhuǎn)膜(恒流300 mA，冰浴轉(zhuǎn)膜2 h)、封閉(TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH7.5)中室溫輕搖90 min，加入GFAP一抗(內(nèi)參用β-Actin 1∶1 000)孵育，4℃冰箱過夜。洗膜，加入羊抗兔-HRP 1∶10 000二抗，室溫孵育60 min。洗膜、ECl反應(yīng)、曝光、顯影、定影，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評分比較 大鼠腦缺血24 h后表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，TFC高、中、低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療14 d后，與模型組比較，TFC高、中、低劑量組神經(jīng)功能缺損評分均顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組腦缺血神經(jīng)功能缺損評分比較

與模型組治療后14 d比較：1)P<0.05,2)P<0.01

2.2各組缺血半暗帶區(qū)腦組織形態(tài)學(xué)變化比較 假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞排列有序，未見水腫，胞體、核仁、核膜清晰。模型組缺血中心區(qū)范圍明確，可見間質(zhì)內(nèi)大小不等的空泡，有散在神經(jīng)細(xì)胞，細(xì)胞界限不清。TFC高、中、低劑量組腦組織可見缺血中心區(qū)減小，缺血周邊區(qū)可見部分神經(jīng)細(xì)胞、胞質(zhì)、胞核尚能分清，有細(xì)胞脫失，結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元數(shù)量較多，變性壞死組織范圍相對較小、程度較輕。見圖1。

2.3各組缺血周邊區(qū)腦組織GFAP表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)比較 治療14 d后，與假手術(shù)組(13.33±5.27)相比，模型組(390.16±78.64)和TFC高(294.68±65.82)、中(356.67±45.20)、低劑量(372.83±41.16)組缺血周邊區(qū)腦組織GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，TFC高、中劑量組大鼠缺血周邊區(qū)腦組織GFAP陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05，P<0.01)，且細(xì)胞生長形態(tài)規(guī)則。見圖2。

2.4各組缺血周邊區(qū)腦組織GFAP蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組(0.59±0.12)比較，模型組(1.71±0.13)和TFC高(1.27±0.16)、中(1.58±0.15)、低劑量(1.62±0.14)組缺血周邊區(qū)腦組織GFAP蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；TFC高、中劑量組大鼠缺血周邊區(qū)腦組織GFAP蛋白表達(dá)量與模型組相比明顯減少(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖1 各組缺血半暗帶區(qū)腦組織形態(tài)學(xué)(×200)

圖2 腦缺血14 d各組缺血半暗帶區(qū)GFAP表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)(×200)

圖3 腦缺血14 d各組缺血半暗帶區(qū)GFAP蛋白表達(dá)

3 討 論

腦缺血致殘的病機(jī)主要是急性腦血管閉塞引起的腦缺血，腦缺血后造成神經(jīng)組織壞死和凋亡，進(jìn)一步造成神經(jīng)功能障礙。有研究認(rèn)為腦梗死后缺血半暗帶區(qū)腦組織損傷可能逆轉(zhuǎn)〔10〕。然而，GFAP是腦內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣的一種神經(jīng)細(xì)胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成部分，參與多種生理反應(yīng)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白〔11〕。已有研究證實，在生理條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞在維持神經(jīng)細(xì)胞外微環(huán)境穩(wěn)定中起重要作用〔12〕；在腦缺血后，星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)反應(yīng)性增生，數(shù)量增多，并且活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞能清除興奮性谷氨酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，維持血腦屏障結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生和釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子〔13～15〕。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度生長可形成膠質(zhì)瘢痕，影響神經(jīng)功能恢復(fù)〔16〕。也有報道，GFAP 在腦損傷后表達(dá)均增強(qiáng)，過度表達(dá)的星形膠質(zhì)細(xì)胞可填充局部損傷的組織缺損，形成的屏障阻礙神經(jīng)組織再生與功能重建，是影響神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的重要原因之一〔17〕。有研究表明，通過抑制GFAP基因表達(dá)，可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞生長和膠質(zhì)瘢痕的形成，從而促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)〔18，19〕。有研究表明，采用反義GFAP mRNA技術(shù)阻止GFAP合成，可減少星形膠質(zhì)細(xì)胞肥大，能緩解損傷后因GFAP過度生長影響神經(jīng)元軸突生長〔20〕。由此可見，通過調(diào)節(jié)GFAP表達(dá)，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度增生，可防止膠質(zhì)瘢痕形成，從而促進(jìn)損傷腦組織修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。

本研究結(jié)果顯示，TFC可改善腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，能促進(jìn)損傷神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，TFC既可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞生長，又可抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，有利于促進(jìn)損傷腦組織修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。