劉小燕 陳文江 王 江

(第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院新橋醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400037)

心力衰竭(HF)是臨床常見各種心臟疾病的終末期綜合征，隨著我國人口的老齡化進(jìn)程，HF的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢，據(jù)我國最新心血管病調(diào)查報(bào)告顯示：我國人群慢性心力衰竭患病率為 0.9%(其中男性 0.7%，女性 1.0%)；其患病率隨著年齡增加而顯著上升；我國北方人群發(fā)病率高于南方人群(1.4% vs 0.5%)，且城市人群發(fā)病率高于農(nóng)村人群(1.1% vs 0.8%)〔1〕。HF的主要病因已經(jīng)從風(fēng)濕性瓣膜性心臟病轉(zhuǎn)變成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，而且高血壓、糖尿病、心房顫動(dòng)等都是導(dǎo)致HF的病因。近10余年來，HF的病理生理機(jī)制得到進(jìn)一步研究，同時(shí)新的治療方法被發(fā)現(xiàn)，尤其是干細(xì)胞治療、免疫調(diào)節(jié)治療、基因治療等，為未來HF的治療展現(xiàn)了新希望。近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)在HF的發(fā)生發(fā)展中有復(fù)雜的微小RNA(miRNA)異常表達(dá)，提示miRNA可能參與HF的發(fā)生發(fā)展〔2～5〕。國外研究表明，miRNA-423-5p與HF的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其研究結(jié)果仍存在一定爭議〔6〕，主要可能是與種族、研究樣本等的限制有關(guān)。因此，進(jìn)一步研究miRNA-423-5p與HF的發(fā)病的關(guān)系顯得尤為重要，以達(dá)到早診斷、早預(yù)防、早治療HF的目的。本研究擬從中國人群進(jìn)行miRNA-423-5p與HF的發(fā)病關(guān)系的研究。

1 對象與方法

1.1研究對象 選擇2015年3～9月新橋醫(yī)院入院的HF患者40例，另外納入40例年齡、性別等方面匹配的非HF患者。HF患者按照《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》〔7〕進(jìn)行診斷和分級，HF組均為紐約心臟病學(xué)會(huì)(NYHA)Ⅲ和Ⅳ級。兩組人群在年齡、性別和基本病史方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。于患者入院24 h內(nèi)抽取患者2 ml靜脈血，并分離血漿(3 000 r/min，24℃，10 min)，保存于-80℃冰箱，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)用，并收集患者基本病史和生化檢測指標(biāo)。

1.2miRNA 實(shí)時(shí)熒光定量檢測 按照說明書用Trizol試劑(Invitrogen，美國)提取所獲取患者血漿的總RNA，然后按照miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit，寶生物工程大連有限公司)說明書對所提取總RNA進(jìn)行miRNA的逆轉(zhuǎn)錄，然后按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量：95℃預(yù)變性30 s；95℃擴(kuò)增、延伸15 s；60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，以U6作為內(nèi)參，miRNA-423-5p(UGAGGGGCAGAGAGC GAGACUUU)和U6引物由寶生物工程大連有限公司設(shè)計(jì)合成，而其下游引物為試劑盒配備通用引物。本研究采用2-ΔCt相對定量方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：ΔCt(實(shí)驗(yàn)組)=Ct(實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因)-Ct(實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因)；ΔCt(對照組)=Ct(對照組目標(biāo)基因)-Ct(對照組內(nèi)參)。

表1 兩組入選人群基本信息(n，n=40)

1.3miRNA-423-5p生物信息學(xué)預(yù)測 采用生物信息學(xué)軟件miRBase〔7，8〕(http：//mirbase.org/)了解miRNA-423-5p的生物學(xué)功能，并采用其提供的生物信息學(xué)預(yù)測軟件MIRDB、MICRORNA、RNA22、TARGETSCAN〔9～13〕對miRNA-423-5p的靶基因和KEGG (京都基因與基因組百科全書)信號通路等，探討其生物功能和可能致病機(jī)制。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 由武漢博士德生物工程有限公司提供試劑盒(產(chǎn)品號：EK0469)對患者血漿中神經(jīng)生長因子(NGF)-β進(jìn)行檢測，具體操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1血漿中循環(huán)miRNA-423-5p 實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果 HF組miRNA-423-5p的表達(dá)水平(0.074 42±0.009 391)明顯高于非HF組(0.021 14±0.005 048，P<0.000 1)，提示miRNA-423-5p可能與HF的發(fā)生有關(guān)。

2.2miRNA-423-5p的受試者工作特征(ROC)曲線分析 miRNA-423-5p的ROC曲線下面積(AUC)為0.852 8，其95%CI為0.769 1～0.936 5，P<0.000 1，見圖1，提示血漿循環(huán)miRNA-423-5p可以作為HF患者的生物標(biāo)志物。

2.3miRNA-423-5p生物信息學(xué)分析 通過MIRDB、MICRORNA、RNA22、TARGETSCAN等在線生物信息

學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miRNA-423-5p的靶基因主要有：NRSN2(Neurensin-2)、NGF、MAPK1、PIK3CA、IGF1、PRKACA、CPLX2、IMPDH1、KLK4、EVC、C20orf27、TSPAN11、WNT3A、FOXP4、SCN4A、NAT8L、SCAF1、CEND1、MAPKBP1、DDX54、NACC1；其KEGG信號通路主要有Neurotrophin信號通路、Wnt信號通路、醛固酶調(diào)控的鈉的重吸收、胰島素信號通路等，見表2，從其預(yù)測結(jié)果可推測：miRNA-423-5的生物學(xué)功能可能主要與調(diào)控心臟NGF、Neurensin-2、神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路、胰島素受體信號通路和Wnt通路等有關(guān)，有可能主要是影響HF后的神經(jīng)重構(gòu)。NGF屬于對神經(jīng)元的生長、分化、延長存活期具有促進(jìn)作用的生長因子家族，該家族主要包括NGF(主要包括NGF-β，2.5S NGF，7.5S NGF)、BDNF、NT-3、NT-4等，因此，我們選擇NGF-β作為候選靶基因進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 血漿循環(huán)miRNA-423-5p 的ROC曲線

ID號名稱靶基因P值Bonferroni校正后P值hsa04910胰島素信號通路KRAS,MAPK1,PIK3CA,PIK3R3,PPP1R3C,PRKAA1,PRKAA2,PRKACB,PRKX,RAF1,SOCS1,SOCS3,SOS2,TSC10.006 2090.033 248 2hsa04710晝夜節(jié)律CLOCK,CRY1,FBXW11,NPAS2,PRKAA1,PRKAA2,RORA0.000 454 720.075 028 8hsa05414擴(kuò)張型心肌病ADCY9,ADRB1,DAG1,IGF1,ITGA2,ITGA6,ITGB8,PRKACB,PRKX,TNF0.0115 7290.049 258 9hsa04310Wnt信號通路BAMBI,CCND1,CCND2,DAAM1,FBXW11,FOSL1,FZD6,NLK,PLCB1,PPARD,PRICKLE2,PRKACB,PRKX,SMAD4,WNT10A,WNT30.001 478 310.243 922hsa04722神經(jīng)營養(yǎng)因子信號通路CRK,PIK3R20.004 270 660.051 247 9hsa04960醛固酮調(diào)控的鈉重吸收IGF1,KRAS,MAPK1,NR3C2,PIK3CA,PIK3R3,SGK10.002 355 660.388 684

2.4兩組血漿NGF-β 表達(dá)比較 HF組血漿NGF-β表達(dá)〔(301.2±10.31)pg/ml〕明顯高于非HF組〔(91.56±8.477)pg/ml，P<0.000 1〕，說明NGF-β可能參與了HF后心臟的神經(jīng)重構(gòu)，也可能為miRNA-423-5p的靶基因。

3 討 論

HF的治療需要不斷的探索和創(chuàng)新，因此，對HF新發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)將為HF的治療提供新途徑和方法。miRNA是一類小非編碼RNA，本身不具有編碼作用卻可以調(diào)控基因的表達(dá)。近年研究證實(shí)血液、尿液等體液中有miRNA存在，稱之為循環(huán)miRNA(cmiRNA)〔14～16〕。cmiRNA通過微小囊泡、與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合和與高密度脂蛋白顆粒結(jié)合形成復(fù)合物而被分泌出來。cmiRNA不依賴于細(xì)胞而存在于體液中，而其在體液中的表達(dá)與它們在細(xì)胞中表達(dá)水平有一定相關(guān)性，并且能夠被受體細(xì)胞攝取而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)〔17，18〕。近年來對于這一不依賴于細(xì)胞而存在的cmiRNA的研究較多，在心血管疾病主要是在急性心肌梗死方面取得一定成果，最近有研究者提出cmiRNA可能是疾病診斷中一種新的、非侵入性的生物標(biāo)志物〔19～21〕。cmiRNA在臨床應(yīng)用的優(yōu)勢主要由于其便于獲取、易于研究，因此cmiRNA與心血管疾病的研究具有一定前景。本研究提示在HF患者血漿中循環(huán)miRNA-423-5p可以作為HF發(fā)生新的生物標(biāo)志物，為HF臨床的診治提供了新的途徑和方法；且miRNA-423-5p有可能主要是通過NGF及其信號通路等影響HF后的神經(jīng)重構(gòu)；NGF-β可能參與HF的發(fā)生，并可能為miRNA-423-5p的靶基因。由于miRNA調(diào)控基因的多樣性和復(fù)雜性及本研究所用研究人群較小，因此，關(guān)于循環(huán)miRNA-423-5p與HF發(fā)病機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步研究，關(guān)于NGF-β與心衰的具體機(jī)制和其與miRNA-423-5p是否互為調(diào)控或者為其靶基因，還有待后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。